陳會君，李力恒，徐倩，張晶，劉志平，周亞濱*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

慢性病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，主要包括病毒核酸在心肌中低水平持續(xù)復(fù)制而引起的直接心肌損傷以及由病毒激活并維持的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的間接心肌損傷。其中免疫損傷、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等是慢性病毒性心肌炎的主要機(jī)制[1]。p38MAPK通道是諸多引起心肌纖維化的因素的共同通路[2-3]。

慢性病毒性心肌炎的治療一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，近年來，免疫抑制劑如腎上腺皮質(zhì)激素、干擾素、FK506、環(huán)孢素、IL-6等的應(yīng)用雖取得了一定的臨床療效，但同時(shí)也存在難以克服的局限性。由于免疫反應(yīng)在慢性病毒性心肌炎的發(fā)病及演變過程中起重要作用，而課題組在前期的研究中證實(shí)了中藥蘇木具有明確的免疫抑制作用，并且確定乙酸乙酯提取物是其免疫抑制的有效部位，故本研究選用蘇木乙酸乙酯提取物作為治療藥物，通過觀察其對慢性病毒性心肌炎小鼠心臟功能、心肌組織p38MAPK mRNA的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

近交系純種Balb/c健康雄性小鼠145只，SPF級，3～4周齡，體質(zhì)量(10±2)g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物合格證號：SYXK(滬)2009-0082。鼠糧為清潔級小鼠生長繁殖顆粒飼料，每籠10只，層流架內(nèi)分籠飼養(yǎng)于溫度為20 ℃～24 ℃、濕度為50%～55%的屏障環(huán)境中。飼養(yǎng)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)病毒

柯薩奇B3病毒(CVB3)Nancy株，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈。半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)為103.75,培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[4]。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

1.1.3.1 蘇木乙酸乙酯提取物

蘇木原材，購于黑龍江省藥材公司，產(chǎn)于云南省。蘇木提取方法參見文獻(xiàn)[5]。將蘇木乙酸乙酯提取物溶于0.2%羧甲基纖維素鈉溶液中，制備成濃度為70 mg/mL蘇木乙酸乙酯提取物溶液。

1.1.3.2 環(huán)孢素軟膠囊

規(guī)格為25 mg/粒，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H10960009，批號：20120501。將根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比例系數(shù)換算，確定Balb/c小鼠每日服藥劑量18.2 mg/kg。刺破膠囊，擠出油狀藥物，溶解到0.2%羧甲基纖維素鈉溶解中，配制成濃度為3.0 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.4 羧甲基纖維素鈉

將20 mg溶于10 mL蒸餾水中，配制成0.2%的羧基纖維素鈉溶液，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

PCR引物：P38MARK 上游：5′-CGTTTGTGCCTATTGTTCTTGTT-3′，下游：5′-TGATCCATTGCTTTACCGTCTAC-3′；Beta Actin上游：5′-CCATTGAACACGGCATTG-3′，下游：5′-TACGACCAGAGGCATACA-3′。

1.1.5 主要儀器

Vevo 770超聲診斷儀(加拿大VisualSonics公司)；6010可見-紫外分光光度計(jì)(美國安捷倫上海分析器廠)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；7500型定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型復(fù)制

雄性Balb/c小鼠145只，隨機(jī)抽取10只作為空白對照組，其余135只小鼠用于模型復(fù)制。將TCID50為103.75的CVB3用MEM Eagle稀釋至10-5，用1 mL注射器抽取,腹部推注病毒稀釋液0.1 mL，第15天采用如上方法給每只小鼠注射病毒稀釋液0.15 mL，第30天給每只小鼠注射病毒稀釋液0.2 mL?？瞻讓φ战M于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射同體積的MEM Eagle液。于實(shí)驗(yàn)第15、30、45天各脊髓脫臼法處死2只模型小鼠，HE染色觀察心肌病理組織，出現(xiàn)了典型的慢性心肌炎的病理變化，證實(shí)模型成功。第45天共計(jì)存活77只小鼠，隨機(jī)抽取75只作為慢性病毒性心肌炎模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

共分為4組,將10只腹腔射MEM Eagle液的小鼠作為空白對照組；將75只造模成功的病毒性心肌炎小鼠，隨機(jī)分為3組，即模型對照組、環(huán)孢素組、蘇木乙酸乙酯提取物組(簡稱蘇木組)，每組25只。

空白對照組和模型對照組小鼠每天灌服羧甲基纖維素鈉溶液0.2 mL。蘇木組小鼠灌服700 mg/(kg·d)蘇木乙酸乙酯提取物羧甲基纖維素鈉溶液，每天灌胃量為0.2 mL。環(huán)孢素組小鼠灌服30 mg/(kg·d)環(huán)孢素羧甲基纖維素鈉溶液，先灌胃10 d；然后改為20 mg/(kg·d)環(huán)孢素羧甲基纖維素鈉溶液，灌胃10 d。每天灌胃量為0.2 mL。

以上溶液羧甲基纖維素鈉的濃度均為0.2%。灌胃藥物每天灌胃前隨用隨配。各組Balb/c小鼠均于實(shí)驗(yàn)第45天開始灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃20 d。

1.2.3 標(biāo)本采集

于實(shí)驗(yàn)第65天采用頸椎脫臼的方法處死全部存活的小鼠進(jìn)行標(biāo)本采集。給小鼠做常規(guī)固定、消毒、開胸，取出心臟后立即放入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中，將殘余血液沖洗干凈，再用濾紙吸干，觀察心臟外觀，用電子天平稱量心臟重量。然后沿左室長軸將心臟分成兩份，一份用10%中性福爾馬林溶液固定，用于HE、VG染色和免疫組化檢查。一份液氮冷凍后放入-70 ℃低溫冰箱凍存，用于PCR檢測。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠一般狀態(tài)

觀察各組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的精神、活動(dòng)狀態(tài)、飲食飲水、毛色形態(tài)變化等狀況，并詳細(xì)記錄小鼠的死亡情況。

1.3.2 超聲心動(dòng)圖檢查

灌胃結(jié)束后，對各組小鼠進(jìn)行心臟超聲檢查。

1.3.3 Real-Time PCR法觀察心肌組織p38MAPK mRNA

灌胃結(jié)束后，取材心臟對各組小鼠心肌組織進(jìn)行p38MAPK mRNA測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般狀態(tài)

空白對照組小鼠皮毛光澤，肌肉充實(shí)，正常飲食、活動(dòng)，明顯體重增加，無死亡。慢性病毒性心肌炎模型小鼠首次注射病毒第3天開始出現(xiàn)精神萎靡，飲食下降，消瘦，皮毛凌亂、毛糙無光澤，易激惹或?qū)ν饨绶磻?yīng)淡漠，第4天開始出現(xiàn)死亡，共計(jì)存活小鼠77只，隨機(jī)取75只作為病毒性心肌炎模型小鼠進(jìn)行灌胃。灌胃后，模型小鼠仍精神萎靡，飲食不佳飲，皮毛凌亂，消瘦。5 d后，蘇木組小鼠的狀態(tài)明顯好于模型對照組和環(huán)孢素組。灌胃期間，模型對照組小鼠死亡7只，環(huán)孢素組死亡12只，蘇木組死亡5只。

2.2 小鼠心臟超聲檢查結(jié)果

病毒感染后各組小鼠心腔都有不同程度擴(kuò)大,心室壁活動(dòng)度減弱,左室收縮末期與舒張末期內(nèi)徑不同程度增大，左心室功能減退。結(jié)果見圖1。與空白對照組相比, 模型對照組小鼠LVEDD與LVESD顯著擴(kuò)大(P<0.01)；與模型對照組相比，環(huán)孢素組和蘇木組的LVEDD和LVESD均明顯減小(P<0.05)；蘇木組與環(huán)孢素組比較無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比,模型對照組小鼠左室EF與FS值顯著下降(P<0.01)；與模型對照組相比，環(huán)孢素組與蘇木組小鼠的左室EF與FS值均明顯增加(P<0.05)；蘇木組與環(huán)孢素組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1、表2。

圖1 各組小鼠心臟彩超情況

表1 各組小鼠左室舒張期末、收縮期末內(nèi)徑比較

表2 各組小鼠左室收縮功能比較

2.3 小鼠心肌組織p38MAPK mRNA表達(dá)

與空白對照組相比，模型對照組的p38MAPK mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型對照組相比，環(huán)孢素組、蘇木組的p38MAPK mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；環(huán)孢素和蘇木組的p38MAPK mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

注：與空白對照組比較，▲P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05。

3 討論

慢性病毒性心肌炎是西醫(yī)學(xué)病名，根據(jù)其主要臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“心悸”“胸痹”范疇；在國家標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》中稱之為“心癉”。本病病位在心，外感六淫是本病的主要致病因素，其中尤以風(fēng)熱、風(fēng)溫最為常見。病機(jī)主要為溫?zé)嵊嘈傲魬?，傷及氣陰，瘀血阻絡(luò)。

蘇木，性味甘、咸、辛、涼，歸心、肝、脾、胃經(jīng)，可活血散瘀、消腫止痛?！缎滦薇静荨吩疲骸爸髌蒲a(chǎn)后血脹悶欲死者。”《本草求真》中對蘇木有“功用有類紅花，少用則和血，多用則破血”的記載。古代醫(yī)家多用于治療跌打損傷，痛經(jīng)，血滯經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀血腹痛，心腹疼痛，癰腫瘡毒等。蘇木是課題組上世紀(jì)90年代從眾多活血化瘀藥中篩選出的免疫抑制作用較為突出的中藥材之一。

本實(shí)驗(yàn)中，病毒感染各組小鼠心腔都有不同程度擴(kuò)大, 心室壁活動(dòng)度減弱,左室收縮末期與舒張末期內(nèi)徑不同程度增大，左心室功能減退。其中模型對照組小鼠左室明顯擴(kuò)大，射血分?jǐn)?shù)與縮短分?jǐn)?shù)明顯降低，說明病毒感染后小鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，呈慢性病毒性心肌炎、心衰甚至向擴(kuò)張型心肌病發(fā)展[6-7]。與模型對照組相比，環(huán)孢素組與蘇木組左室舒張末與左室收縮末徑都明顯減少，射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)卻明顯升高，表明蘇木乙酸乙酯提取物和環(huán)孢素A均具有改善慢性病毒性心肌炎小鼠心功能的作用，二者比較無顯著差異。結(jié)果表明，蘇木乙酸乙酯提取物在改善病毒性心肌炎小鼠心功能方面療效肯定，這可能與其活血祛瘀，消腫止痛，減輕小鼠心肌病理損傷，抑制心肌纖維化有關(guān)。

p38MAPK在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。p38MAPK與心室重構(gòu)關(guān)系密切[8-9]，當(dāng)心肌細(xì)胞受到刺激后產(chǎn)生炎癥因子，活化p38MAPK通路，誘導(dǎo)心肌蛋白合成，心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而發(fā)生心肌肥厚[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中，與空白對照組相比，模型對照組的p38MAPK mRNA表達(dá)明顯增加，表明病毒感染后，p38MAPK通道受到病毒刺激而被活化，被活化的p38MAPK加速CVB3的復(fù)制，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡和成纖維細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)膠原增生，而出現(xiàn)心肌纖維化的病理損傷，導(dǎo)致心肌肥厚，心室重構(gòu)，心臟功能受損，嚴(yán)重者出現(xiàn)心衰的表現(xiàn)，超聲檢查中亦可見心功能減退。而蘇木組的p38MAPK mRNA表達(dá)明顯降低，表明蘇木乙酸乙酯提取物可以抑制p38MAPK活化，切斷p38MAPK通道，抑制病毒的持續(xù)復(fù)制，減少細(xì)胞凋亡，抑制成纖維細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，減弱其分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，從而最終減輕或抑制心肌纖維化，改善心功能。

本研究證實(shí)蘇木乙酸乙酯提取物能夠改善慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的心臟功能，抑制心臟肥大；蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制慢性病毒性心肌炎小鼠心肌組織p38MAPK mRNA的表達(dá)，這可能是其治療慢性病毒性心肌炎的機(jī)制之一。