翟旭楠，劉永武，張娜，趙良友，杜兆遠(yuǎn)，范卓文

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺五加為五加科植物刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms]的干燥根和根莖或莖[1]。由于對生長環(huán)境要求低、耐寒、種植技術(shù)簡單等原因，所以刺五加廣泛分布于我國東北、華北及小興安嶺等地區(qū)[2]。刺五加富含活性物質(zhì)，可以增強(qiáng)人體活力并調(diào)節(jié)新陳代謝。同時(shí)刺五加還具有治療厭食和失眠的作用[3]。多糖廣泛存在于天然高分子化合物中，主要分布于動(dòng)植物及微生物的細(xì)胞壁中[4]。植物多糖是植物自身新陳代謝中產(chǎn)生的，具有來源清楚、毒副作用小、分布廣泛、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、畜牧生產(chǎn)、食品加工等方面[5]。中藥多糖普遍存在于菌類、藻類等藥材中，研究表明中藥多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血糖、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等生物活性[6-8]。刺五加多糖是刺五加的有效活性成分之一，由葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等組成[9]。本實(shí)驗(yàn)通過碳粒廓清實(shí)驗(yàn)考察刺五加多糖對吞噬細(xì)胞的吞噬作用，并進(jìn)行溶血素抗體實(shí)驗(yàn),對刺五加多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步探討。

1 材料

1.1 儀器

電子分析天平(上海精科天美貿(mào)易有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；EDTAK2真空采血管(山東康華醫(yī)用耗材有限公司)；一次性真空采血管(揚(yáng)州市華威醫(yī)療器械有限公司)；RT-600全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Rayto雷杜公司)；雷勃爾LD25-2離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 藥品及試劑

刺五加多糖(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號：XC20130515)；印度墨汁(德制Chroma牌，80 mg碳粒/mL)；綿羊紅細(xì)胞(石家莊華瑞創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)中心，批號：20141117)；都氏液(石家莊華瑞創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)中心，批號：201409)；胸腺五肽(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號：20058462)；環(huán)磷酰胺(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，批號；201610068)；Na2CO3(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 動(dòng)物

來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，BALB/c 小鼠，100只，雌雄各50只，體質(zhì)量20 g左右，證書號為 P00102014；英國種豚鼠，10只，雌雄各5只，體質(zhì)量200 g左右，證書號為P00112014。

2 方法

2.1 ASPS對單核吞噬細(xì)胞影響

BALB/c小鼠60只，采用隨機(jī)方法分為6組。分別記為空白組、模型組、陽性藥組、ASPS低劑量組[36.25 mg/(kg·d)]、中劑量組[72.5 mg/(kg·d)]、高劑量組[145 mg/(kg·d)]。陽性藥組注射胸腺五肽[10 mg/(kg·d)]；多糖組連續(xù)7 d，每日灌胃給藥1次；除空白組外，在試驗(yàn)第 5、6、7 天注射環(huán)磷酰胺注射液0.1 mL(80 mg/kg)[10]。最后一次給藥后24 h，將0.1 mL/10 g的稀釋印度墨水(用1%明膠稀釋4倍)注入尾靜脈。注入墨水2 min和6 min后，從眼靜脈叢中抽取20 μL血液，立即將其加入含有2 mL 0.1% 碳酸鈉的試管中?？瞻讓φ諛訛?.1% Na2CO3溶液，在600 nm下測定光密度值。稱重小鼠脾臟及胸腺，計(jì)算廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)和臟器指數(shù)。

2.2 ASPS對溶血素抗體生成影響

參考文獻(xiàn)[11]方法。BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為4組。分別記為空白組、ASPS低劑量組[36.25 mg/(kg·d)]、中劑量組[72.5 mg/(kg·d)]、高劑量[145 mg/(kg·d)]。對照組小鼠每天采用0.1 mL/10 g，0.9%NaCl溶液灌胃1次，多糖組每日灌胃多糖1次，持續(xù)14 d。在給藥8 d后，連續(xù)7 d經(jīng)腹腔注射0.2 mL綿羊紅細(xì)胞混懸液誘發(fā)免疫反應(yīng)。最后一次給藥40 min后，眼底取血，離心5 min。將血清與生理鹽水按1:300比例稀釋，取稀釋血清1.0 mL，同一試管中加入綿羊紅細(xì)胞0.5 mL，再加入10%豚鼠血清1.0 mL。37 ℃溫育10 min，冰水浴終止反應(yīng)，離心。在540 nm處分別測定1.0 mL上清液與3.0 mL都氏液混合溶液的OD值，0.25 mL綿羊紅細(xì)胞與3.75 mL都氏液混合溶液的OD值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 ASPS對小鼠免疫器官指數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

模型組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)與空白組之間差異顯著(P<0.01)，提示造模成功。陽性藥組和ASPS高劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、α值與模型組比較都顯著性增加(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ASPS中劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、α值與模型組相比只有胸腺指數(shù)顯著性升高(P<0.01)，其余均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ASPS低劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、α值與模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此可推論ASPS能增強(qiáng)免疫抑制小鼠的吞噬功能。結(jié)果見表1。

表1 ASPS對小鼠免疫器官指數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

3.2 ASPS對正常小鼠溶血素抗體生成的HC50的影響

在小鼠產(chǎn)生溶血素抗體的實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比刺五加多糖給藥組的HC50均有升高，其中高劑量組與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中、低劑量組相較于對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。因此推斷，ASPS可以促進(jìn)綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的溶血素產(chǎn)生并增強(qiáng)免疫力。結(jié)果見表2。

表2 ASPS對正常小鼠溶血素抗體生成的HC50的影響

4 討論

本研究以BALB/c系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為了研究 ASPS對免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子的影響，使用了碳粒廓清法，并進(jìn)行了ASPS對溶血素抗體生成影響實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了刺五加多糖對增強(qiáng)免疫力的作用。

免疫是一種保護(hù)性的生理反應(yīng)，為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和平衡而對外來異物進(jìn)行識別和排除[12-14]。免疫調(diào)節(jié)主要依靠免疫系統(tǒng)進(jìn)行，免疫系統(tǒng)由免疫細(xì)胞(T、B淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等)、免疫器官(胸腺、脾臟等)、免疫分子(淋巴因子、溶菌素等)組成。巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，是一種多功能效應(yīng)細(xì)胞，單核吞噬細(xì)胞分布于全身各器官中，當(dāng)外來抗原性異物進(jìn)入機(jī)體后，吞噬細(xì)胞對其進(jìn)行識別、處理并將其呈遞給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞增殖分化，引起進(jìn)一步的免疫反應(yīng)。因此，吞噬細(xì)胞作為體液免疫的第一關(guān)卡，其吞噬機(jī)能可作為反應(yīng)機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一。

免疫細(xì)胞可分為多種，其中最主要的就是T、B淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中擔(dān)當(dāng)著重要的角色。T細(xì)胞在胸腺分化成熟，B細(xì)胞在骨髓中分化成熟，兩者都聚積于脾臟，所以一旦發(fā)生免疫反應(yīng)胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)都會發(fā)生相應(yīng)變化，能夠直觀地反映機(jī)體的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對胸腺、脾臟指系數(shù)和碳粒廓清指數(shù)進(jìn)行觀測，結(jié)果表明刺五加多糖ASPS可以顯著提高免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

小鼠中的溶血素水平是特異性免疫力的重要指標(biāo)。為加強(qiáng)特異性抗SRBC抗體的產(chǎn)生，將紅細(xì)胞作為一種強(qiáng)抗原異物注入小鼠體內(nèi)，抗體生成并釋放到外周血中，來進(jìn)行溶血素檢測。在有補(bǔ)體參與的情況下，發(fā)生細(xì)胞免疫后的小鼠血清與綿羊紅細(xì)胞共同溫育會產(chǎn)生溶血反應(yīng)，釋放出血紅蛋白，血清中的抗體含量與紅細(xì)胞的溶血程度有關(guān)，溶血程度可以通過顏色來判斷。因此，B細(xì)胞增殖分化的能力與補(bǔ)體結(jié)合分泌溶血素的能力可以通過溶血素?cái)?shù)值來表達(dá)，從而可以反映出機(jī)體的體液免疫能力[15]。本實(shí)驗(yàn)通過綿羊紅細(xì)胞致使小鼠產(chǎn)生溶血素抗體，對口服ASPS后抗體的變化進(jìn)行了相應(yīng)研究。由此可知,ASPS可以提高正常小鼠溶血素HC50，具有增強(qiáng)小鼠體液免疫的功能。