趙峰，楊靖，李志榮，強(qiáng)翠欣，李茹鑫，趙杏珍，王曉明，趙寶鑫，翟宇，李仲興，趙建宏*

(1.石家莊市第一醫(yī)院，河北 石家莊 050000; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,省臨床檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000；3.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是一種革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌。艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)引起的癥狀輕重不一，輕者僅有輕度腹瀉，嚴(yán)重者可引起死亡。2013年和2019年美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)將其列為幾種導(dǎo)致公共健康威脅的微生物之一，耐藥威脅等級(jí)為最高的“緊急”級(jí)別。近年來，艱難梭菌高產(chǎn)毒株(027/NAPl/BI)在美國、加拿大、歐洲許多地區(qū)出現(xiàn)感染暴發(fā)情況以及流行傳播，病死率及復(fù)發(fā)率高[1-3]，在全世界范圍內(nèi)已引起廣泛的關(guān)注。中草藥在我國具有上千年的使用歷史，在目前耐藥菌株大量產(chǎn)生的背景下，我國傳統(tǒng)中草藥卻沒有出現(xiàn)顯著的耐藥情況，這可能是由于中藥獨(dú)特的抗菌(增效)機(jī)制[4]。目前，甲硝唑與萬古霉素是治療CDI的首選藥物[5]。但CD對(duì)甲硝唑耐藥率在逐步增高，且已發(fā)現(xiàn)了對(duì)甲硝唑耐藥和對(duì)萬古霉素敏感性下降的菌株[6]。有研究表明CDI患者在接受萬古霉素、甲硝唑治療30 d以內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)15%～35%，復(fù)發(fā)的患者比初次感染患者治療難度大[7]。此外，Nathwani等研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素治療過程中可使人體正常專性厭氧菌在整個(gè)腸道菌群所占比例減少，兼性厭氧菌和微需氧菌群所占比例增多[8]。這對(duì)臨床治療CDI造成了困難，因此發(fā)現(xiàn)和研制治療CDI的新藥勢(shì)在必行。

本實(shí)驗(yàn)選取了具有收斂固澀作用的五倍子、收濕斂瘡功效的兒茶和清熱燥濕作用的黃連3味中藥，研究其對(duì)CD的體外抗菌活性，為中藥治療CDI提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

微量多點(diǎn)接種儀(日本佐久間制作所)；比濁儀(France BioMerieux公司)；生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；超低溫冰箱(China Haier公司)；精密分析天平(Japan A&D公司)；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌儀(Japan ALP公司)；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(廣州尤德公司)。

1.2 試劑

布魯氏瓊脂(Becton,Dickinson and Company)；布魯氏肉湯(Becton,Dickinson and Company)；氯化血紅素(西安拉維亞生物科技有限公司)；維生素K1(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；氫氧化鈉(天津市大陸化學(xué)試劑廠)；脫纖維羊血(北京陸橋科技有限公司)。

1.3 藥材與產(chǎn)地

五倍子(河北)、兒茶(云南)、黃連(四川)均購自石家莊市中醫(yī)院,經(jīng)由藥師張占鑒定,符合2015版《中國藥典》規(guī)定，為正品。

1.4 菌種

本實(shí)驗(yàn)所用的130株CD均來自河北省醫(yī)學(xué)微生物菌種保存中心(Hebei provincial centre for medical culture collection, HBCMCC)。

2 方法

2.1 中藥水煎劑制備

五倍子和黃連煎液制備以五倍子為例:稱取五倍子50 g,加水適量浸泡35～45 min,一煎30 min,收集煎液,再將藥渣加適量水二煎20 min,兩煎共收集煎液100 mL并過濾，此為50%(1∶2)五倍子水煎液，過濾液無菌儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

兒茶煎液制備:稱取兒茶50 g，切成約0.5 cm×0.5 cm大小。加適量清水浸泡30～40 min，先用武火煮沸，然后改用文火使其保持沸騰，一煎30 min, 收集上清煎液, 再將藥渣加適量水二煎20 min, 兩煎共收集煎液100 mL并過濾。此為50%(1∶2)兒茶水煎液，過濾液無菌儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 中藥瓊脂平板制備

取10只無菌試管并標(biāo)記為1～10號(hào)，在第1號(hào)管中加入50%(1∶2)水煎液2 mL，2～9號(hào)管做水煎液的倍比稀釋。取2 mL無菌蒸餾水分別加入2～9號(hào)管中。在2號(hào)管加入50%(1∶2)中藥過濾水煎液2 mL，混勻后取出2 mL加到第3號(hào)管，混勻，取出2 mL加入到第4號(hào)管，依次方法直到第9號(hào)管。這樣1～9號(hào)管為2 mL的倍比稀釋液，第10號(hào)管加入2 mL無菌蒸餾水做對(duì)照。取無菌培養(yǎng)基瓶10只，每瓶加入溶化的無菌布魯氏瓊脂18 mL，將第1～9號(hào)管的中藥倍比稀釋和10號(hào)管的對(duì)照液分別倒入10只培養(yǎng)基瓶中，混勻后依次倒入1～10號(hào)培養(yǎng)皿平板。1～9號(hào)平板為20 mL含藥瓊脂培養(yǎng)皿，10號(hào)平板為對(duì)照，凝固后備用。第1號(hào)的瓊脂平板實(shí)際含中藥1∶20(5%),第2號(hào)1∶40(2.5%),第3號(hào)1∶80(1.25%),第4號(hào)1∶160(0.625%)……。

2.3 MIC測(cè)定

取CD菌落，配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，然后將CD菌懸液接種到含藥培養(yǎng)皿瓊脂平板和對(duì)照板上，無菌烤箱烘干，置于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察CD生長(zhǎng)情況，記錄MIC值。

2.4 含中藥培養(yǎng)皿的藥物濃度計(jì)算

將熬制的100 mL煎液用濾紙過濾。取20 mL濾液放于50 ℃無菌烤箱中烘干，得出干重量。干重量除以20就是1 mL濾液的中藥含量，再除以瓊脂的稀釋倍數(shù)可得出1 mL瓊脂中含中藥的藥量。例如20 mL兒茶水煎液(1∶2)干重為4 484.6 mg，在第1號(hào)兒茶培養(yǎng)皿中，含布魯氏瓊脂18 mL和煎液2 mL(1∶2)，則培養(yǎng)基兒茶中藥濃度為22.423 mg/mL。

3 結(jié)果

3.1 五倍子、兒茶和黃連對(duì)130株CD的抗菌活性

本實(shí)驗(yàn)研究了五倍子、兒茶和黃連3味中藥對(duì)130株CD的體外抗菌活性。其中以五倍子對(duì)CD的體外抗菌活性最強(qiáng)，其次是兒茶，最弱的是黃連，3味中藥對(duì)CD的抗菌活性見表1。

表1 五倍子、兒茶和黃連對(duì)130株CD的抗菌活性(mg/mL)

3.2 五倍子等3種中藥對(duì)130株CD的累積抑菌率

本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法研究五倍子、兒茶和黃連3味中藥對(duì)CD的抗菌活性，隨著試驗(yàn)藥物稀釋倍數(shù)的增加，3味中藥的抑制菌株數(shù)和累積抑菌率逐漸下降，見表2。

表2 五倍子等3種中藥對(duì)130株CD的累積抑菌率

隨著五倍子藥物濃度的增加，其對(duì)CD的累積抑菌率也在增加，當(dāng)五倍子濃度為0.250 mg/mL時(shí)，累積抑菌率達(dá)100%。五倍子對(duì)CD的累積抑菌百分率見圖1。

圖1 五倍子對(duì)130株CD的累積抑菌百分率(%)

兒茶濃度為22.423 mg/mL時(shí)，累積抑菌率達(dá)100%。兒茶對(duì)130株CD的累積抑菌百分率見圖2。

圖2 兒茶對(duì)130株CD的累積抑菌百分率(%)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連只對(duì)12株(9.2%)CD有抑菌作用，對(duì)另外118株CD無抗菌作用。黃連的累積抑菌百分率見圖3。

圖3 黃連對(duì)130株CD的累積抑菌百分率(%)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以水煎液為研究對(duì)象，與中藥劑型中的“湯劑”一致。中藥湯劑在我國已有千年的歷史?！夺樉募滓医?jīng)》序言有“湯液始于伊尹”之說，說明湯劑在商代就已出現(xiàn)。五倍子作為傳統(tǒng)中藥，在《開寶本草》就有記載，具有澀腸固精、收濕斂汗等多種臨床功效[9]?；瘜W(xué)成分以五倍子鞣質(zhì)為主，鞣質(zhì)是一種復(fù)雜的酚類化合物，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，是倍酰葡萄糖的化合物，即葡萄糖上的醇羥基與沒食子酸上的羥基所形成的酯類化合物。β-五-間雙沒食子酰葡萄糖的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了五倍子鞣質(zhì)特有的抗菌活性[10]。五倍子對(duì)細(xì)菌、真菌有很強(qiáng)抑菌作用[11-12]。李仲興等發(fā)現(xiàn)五倍子對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有抑菌效果[13-14]。并發(fā)現(xiàn)五倍子對(duì)表皮葡萄球菌的抗菌作用是干擾細(xì)胞壁合成的同時(shí)損傷細(xì)胞膜，使細(xì)菌溶解，破裂死亡。五倍子對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)體外抗菌活性，其抗菌作用強(qiáng)于黃連和黃芩[15]。本實(shí)驗(yàn)中五倍子對(duì)130株CD的MIC90為0.225 mg/mL，也就是說，當(dāng)五倍子水煎液的藥物濃度達(dá)到0.225 mg/mL時(shí)，就可以抑制130株中90%的CD菌株。但五倍子對(duì)CD的抑菌作用具體機(jī)制不詳，是否是鞣質(zhì)對(duì)CD單獨(dú)有抗菌作用，還是和其他成分共同發(fā)揮抑菌作用這還有待于進(jìn)一步的研究。其他五倍子劑型是否與湯劑一樣具有體外CD抗菌作用也有待于研究。此外，我國五倍子分布在十余個(gè)省份，藥材除應(yīng)選取道地藥材外，還應(yīng)注意藥材的產(chǎn)地。不同省份的五倍子藥材對(duì)細(xì)菌體外抑菌效果有差異。有研究發(fā)現(xiàn)河北、浙江、陜西、云南、湖南所產(chǎn)五倍子體外抑菌效果較強(qiáng)，其中云南產(chǎn)五倍子鞣質(zhì)對(duì)金葡菌、大腸桿菌、綠膿桿菌體外抑菌效果明顯，陜西、浙江產(chǎn)五倍子鞣質(zhì)對(duì)白色念株菌的有較強(qiáng)體外抑菌效果[16]。本研究中所用的五倍子產(chǎn)地為河北，不同省份的五倍子對(duì)CD的抑制作用如何還需進(jìn)一步研究比較。

兒茶是一種常用的中藥材，廣泛種植于氣候濕潤地區(qū),具有收濕斂瘡、止血等功效。本實(shí)驗(yàn)中兒茶對(duì)CD有體外抗菌活性，其MIC范圍是4.128～ 22.423 mg/mL。兒茶的MIC范圍較大，最大值和最小值相差約6倍。對(duì)其原因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其MIC值為4.128 mg/mL的菌株僅1株，PCR核糖體型別為HB24。MIC值為22.423 mg/mL的菌株也僅1株，其PCR核糖體型別為HB9。其他型別的MIC為8.100 1～16.200 3 mg/mL。由此推測(cè)兒茶的MIC值與艱難梭菌的PCR核糖體分型有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)的艱難梭菌樣本數(shù)僅130株，因此需要增加樣本量來進(jìn)一步確認(rèn)它們之間的關(guān)系。兒茶中含有黃酮和酚酸類成分。研究發(fā)現(xiàn)兒茶水煎液對(duì)金葡菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌有體外抑制作用[17]，但其對(duì)細(xì)菌的具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中黃連只對(duì)12株CD有抗菌活性，對(duì)另外118株CD無抑制作用，抑菌率為9.2%。這可能是由于黃連水煎液藥物濃度較低，沒有達(dá)到有效的抗菌作用濃度。其次可能是黃連本身對(duì)CD抗菌能力弱。本實(shí)驗(yàn)的黃連產(chǎn)地為四川，不同的產(chǎn)地，氣候條件、溫濕度變化等因素均可能影響藥效。

本研究發(fā)現(xiàn)五倍子、兒茶和黃連對(duì)CD均有抑制作用。五倍子對(duì)CD的抗菌活性最強(qiáng)，其次是兒茶，最后是黃連。但這僅是體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，至于體內(nèi)作用如何，尚需進(jìn)一步的研究。我國地跨溫帶和亞熱帶，適宜中藥材的生長(zhǎng)。研究中藥方劑對(duì)CD的抗菌作用，可以為臨床采用中藥治療CDI提供新的治療途徑和思路。