王博寒,史鎖芳

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)，是一種以可逆性的氣道高反應(yīng)為特點、由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。全球約有3億哮喘患者，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。哮喘的發(fā)病機制尚未明確，除了氣道高反應(yīng)、免疫-炎癥反應(yīng)等，氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位，如“氧化/抗氧化失衡”、氣道“自由基損傷”等學(xué)說[2]。氧化應(yīng)激可以刺激MUC5AC過表達(dá)，使黏液分泌增多，限制黏膜纖毛擺動，降低氣道清除能力，進而形成黏液栓引起氣道阻塞，是哮喘死亡的重要因素之一[3]。故抑制氧化應(yīng)激減少MUC5AC表達(dá)在哮喘的治療過程中尤為重要。白藜蘆醇具有多種生物活性，是公認(rèn)的具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用和癌癥化學(xué)預(yù)防劑[4]。深入挖掘氧化應(yīng)激在哮喘中的作用機理，探究白藜蘆醇抗氧化應(yīng)激在哮喘治療中的作用靶點具有重要的意義?；谝陨险J(rèn)識，本實驗以人氣道上皮細(xì)胞16HBE為研究對象，并通過H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，加以白藜蘆醇干預(yù)，檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)以及MUC5AC表達(dá)水平，探討白藜蘆醇對H2O2作用下人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人氣道上皮細(xì)胞16HBE(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；白藜蘆醇(S1396)(美國Selleck 生物科技有限公司)；胎牛血清(41F9144K)、RPMI 1640培養(yǎng)基(8117079)、青霉素-鏈霉素(C0222)(美國Thermo fisher scientific公司)；H2O2(101830329)(美國Sigma公司)；活性氧ROS測試盒(E004-1-1)、總抗氧化能力T-AOC測試盒(A015-1-2)(南京建成生物工程研究所)；MUC5AC抗體(sc-21701)(美國Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG(7074S)(美國Cell Signaling科技公司)；蛋白裂解液(106M4000V)、蛋白酶抑制劑(410035)、磷酸酶抑制劑(510024)(瑞士Biotool公司)；BCA蛋白定量試劑盒(P0010)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光顯色液(170-5060)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 主要儀器

HeraCell 150i型培養(yǎng)箱(美國Thermo fisher scientific公司)；Ni-U型正置熒光顯微鏡(德國Jena公司)；125-BR垂直電泳儀、221-BR電轉(zhuǎn)移裝置、ChemiDocTM型成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；VIIA7DX型實時熒光定量PCR儀(新加坡 Life technologies公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

配制含有10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時用0.5%胰蛋白酶消化進行后續(xù)實驗。

分組1:①對照組；②H2O2不同濃度組(H2O2濃度分別為5、10、20 μmol/L)，均處理48 h。

分組2：將細(xì)胞分為H2O2不同時間組(5 h、24 h、48 h、72 h)。分別予以H2O220 μmol/L干預(yù)細(xì)胞相應(yīng)時間。

分組3：①對照組；②H2O2組(H2O220 μmol/L)；③H2O2+白藜蘆醇組(H2O220 μmol/L+白藜蘆醇50 μmol/L)；④白藜蘆醇組(白藜蘆醇50 μmol/L)，均處理24 h。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 活性氧ROS水平

按“分組1”和“分組3”相應(yīng)要求處理后的16HBE細(xì)胞，采用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋 DCFH-DA熒光探針，稀釋比例為1∶1 000，每孔加入500 μL，放置培養(yǎng)箱避光孵育30 min。棄去孔內(nèi)液體，PBS沖洗2次，每孔加入PBS 500 μL熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 總抗氧能力T-AOC水平

按“分組3”相應(yīng)要求處理后的16HBE細(xì)胞進行T-AOC檢測。1)配制測定管及對照管溶液，充分混勻后置于37 ℃水浴鍋水浴30 min。2)對照管和測定管中分別加入4號試劑和5號試劑，測定管加樣品。3)漩渦震蕩充分混勻后，采用酶標(biāo)儀設(shè)置吸光度為520 nm測定吸光度。

細(xì)胞中T-AOC能力=(測定管OD值-對照管OD值)/0.3×40/待測蛋白濃度

1.4.3 MUC5AC蛋白表達(dá)水平

采用Western blot法檢測MUC5AC蛋白表達(dá)水平。按“分組1”和“分組3”要求處理后棄去原有培養(yǎng)液，16HBE細(xì)胞PBS清洗后加入適量體積細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞裂解液上清采用BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后切取目的條帶。5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入MUC5AC和β-actin抗體4 ℃過夜。TBST洗滌后加入羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后采用ECL發(fā)光液顯色。實驗結(jié)果采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.4.4 MUC5AC mRNA水平

采用RT-PCR法檢測MUC5AC mRNA水平。按“分組1”“分組2”和“分組3”要求處理后棄去原有培養(yǎng)液，16HBE細(xì)胞采用PBS清除培養(yǎng)基后加入RNAiso Plus分離總RNA。采用 First-Strand Synthesis 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。取逆轉(zhuǎn)物產(chǎn)物進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 共 45個循環(huán)，以 β-actin基因為內(nèi)參，引物設(shè)計如下：

β-actin:上游5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，下游5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′，MUC5AC：上游5′GCTTCCTGCTCCGAGATGT3′,下游 5′AAGACGCAGCCCTCATAGAA3′。

通過計算 2-ΔΔCt分析MUC5AC mRNA相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激

DCFH-DA探針檢測“分組1”的 16HBE細(xì)胞ROS水平，結(jié)果顯示H2O2作用后可以增高16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且隨著H2O2濃度升高，ROS水平也隨之升高。見圖1。

圖1 H2O2誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激

2.2 H2O2誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞MUC5AC表達(dá)量

RT-PCR法檢測“分組1”和“分組2”MUC5AC mRNA水平，結(jié)果顯示H2O2作用后16HBE細(xì)胞的MUC5AC mRNA水平隨濃度升高而升高，與對照組比較，20 μmol/L H2O2作用后MUC5AC mRNA水平升高了約6倍(P<0.001)，見圖2A。H2O2不同時間組(5 h、24 h、48 h、72 h)MUC5AC mRNA水平比較，作用24 h的MUC5AC mRNA水平最高，比對照組升高了約5倍(P<0.001)，見圖2B。Western blot法檢測“分組1”的MUC5AC蛋白水平，與對照組比較，20 μmol/L H2O2作用后MUC5AC蛋白水平升高了約2倍(P<0.001)，見圖2D。綜上，H2O2能夠誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞MUC5AC表達(dá)量增加，H2O220 μmol/L干預(yù)24 h MUC5AC表達(dá)量最高。

注:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 白藜蘆醇抑制H2O2誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激

檢測“分組3”的 16HBE細(xì)胞ROS和T-AOC水平，20 μmol/L H2O2作用后可以升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而加入白藜蘆醇50 μmol/L共同作用后可以抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，見圖3A。對于T-AOC水平，20 μmol/L H2O2作用后T-AOC水平較對照組降低了約2/7(P<0.05)，與H2O2組比較，H2O2+白藜蘆醇組的T-AOC水平升高了約0.3倍(P<0.05)，見圖3B。

注:*P<0.05。

2.4 白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)

檢測“分組3”的16HBE細(xì)胞的MUC5AC mRNA水平和MUC5AC蛋白水平，與對照組比較，H2O2組的MUC5AC mRNA水平升高了約5倍(P<0.001)，MUC5AC蛋白水平升高了約0.8倍(P<0.001)。與H2O2組比較，H2O2+白藜蘆醇組的MUC5A CmRNA水平降低了約5/6(P<0.001)，MUC5AC蛋白水平降低了約2/5。說明白藜蘆醇能夠逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)(P<0.001)。見圖4。

注:***P<0.001。

3 討論

在人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的情況下，氧化和抗氧化處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。氧化應(yīng)激是指在多種理化刺激及自身免疫等因素的影響下，體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS，氧化程度超出了氧化物的清除，氧化和抗氧化處于失衡狀態(tài)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤和氧化損傷。大量臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是哮喘發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一[5]。氧化應(yīng)激啟動并加重炎癥反應(yīng)，其主要物質(zhì)活性氧ROS是一種強化學(xué)介質(zhì)，能作用于細(xì)胞膜的受體激酶，調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活對氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，使其與MUC5AC基因?qū)?yīng)的位點結(jié)合，促進 MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄與翻譯，導(dǎo)致氣道黏液過度分泌[6]。因此針對黏液分泌的信號通路進行抗氧化應(yīng)激處理，能夠有效抑制黏液高分泌?；诎邹继J醇的抗氧化、抗炎等作用，本實驗提出了白藜蘆醇能夠抑制氧化應(yīng)激減少黏蛋白MUC5AC表達(dá)的假說。

ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為中起到重要作用。過量的ROS能夠損傷細(xì)胞的大分子結(jié)構(gòu)例如DNAs，類脂和蛋白質(zhì)，造成組織損傷，參與黏液高分泌[7]。T-AOC代表的是機體總抗氧化體系，包括了抗氧化酶(如SOD等)、非抗氧化酶(H2S等)兩類抗氧化系統(tǒng)，這些抗氧化物質(zhì)能夠清除自由基，減輕氧化應(yīng)激對機體的損傷[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激16HBE細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，T-AOC水平降低，證實H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型成立。白藜蘆醇作用后，與模型組相比，ROS水平降低，T-AOC水平升高，證實白藜蘆醇具有抑制氧化應(yīng)激的作用。

氣道黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理學(xué)改變之一[8]，黏液分泌增多會導(dǎo)致纖毛清除功能受損，進而形成黏液栓，引起氣道阻塞、氣流受限，并為細(xì)菌感染提供機會。黏蛋白是氣道黏液的主要成分，由氣道上皮杯狀細(xì)胞及黏膜下腺體產(chǎn)生，可分為膜結(jié)合型和分泌型。MUC5AC為分泌型黏蛋白，是哮喘發(fā)作時氣道黏液中的主要黏蛋白，對維持正常的黏液彈性和纖毛清除功能起著重要作用。故MUC5AC的過量表達(dá)可以作為氣道黏液高分泌形成的主要標(biāo)志[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，用H2O2刺激16HBE細(xì)胞后，MUC5AC mRNA及其蛋白表達(dá)明顯增高，揭示H2O2能夠誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞MUC5AC表達(dá)量增加。而白藜蘆醇作用后，與模型組相比，MUC5AC mRNA及其蛋白表達(dá)明顯降低，證實白藜蘆醇能夠逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的MUC5AC過表達(dá)。

黏蛋白合成的機制研究眾多，且較為復(fù)雜，已知MAPK/p38、JAK/STAT、Ras/Raf/Erk/MAPK等信號通路均在其合成過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。對于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黏液高分泌的具體機制尚不明確，本研究通過體外實驗進一步驗證了氧化應(yīng)激與MUC5AC過表達(dá)相關(guān)，且白藜蘆醇能夠抑制氧化應(yīng)激減少MUC5AC表達(dá)，然而其具體作用機制仍待進一步研究。