張超

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由于遺傳和環(huán)境因素引起的一組以高血糖為特征的臨床綜合征[1]。是胰島素缺乏或(和)胰島素作用障礙等引起的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等的代謝紊亂，其臨床表現(xiàn)為多飲、多尿、多食以及消瘦等[2-3]。目前研究認(rèn)為，脂肪組織不僅作為儲(chǔ)藏能量的人體組織，而且可作為能在機(jī)體生命代謝中起關(guān)鍵性作用的組織器官[4]。脂肪組織能夠分泌相關(guān)因子，并以內(nèi)分泌、旁分泌等途徑參與機(jī)體的生理功能，調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5]。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)血糖(FBG、2hBG、14dBG)、血脂(TG)、胰島素(INS1、INS2)、脂肪因子(LEP)以及新型脂肪因子(Apelin、vaspin)指標(biāo)的表達(dá)，分析脂肪因子與糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性普通級(jí)Wistar大鼠，3月齡，體質(zhì)量(200±30)g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件為一級(jí)環(huán)境條件下飼養(yǎng),溫度控制在20 ℃～28 ℃,控光(12 h明暗相間),自由飲水、采食。

1.2 藥品、試劑及儀器

1.2.1 藥品

復(fù)脾湯藥物組成：人參10 g，黃芪12 g,茯苓12 g，五味子12 g，山藥12 g，麥冬10 g，葛根10 g，天花粉10 g，雞內(nèi)金12 g，炒麥芽10 g和炒神曲10 g。由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供藥材和代煎，湯劑濃度:相當(dāng)于生藥1 kg/L。二甲雙胍(0.5 g/片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20041986，北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)。

1.2.2 試劑

大鼠瘦素(LEP)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：E-EL-R0582c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：E-EL-R2466c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠內(nèi)臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：E-EL-R1066c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠Apelin(APLN)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：E-EL-R2413c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2.3 儀器

One Touch強(qiáng)生血糖儀(強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器材有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(Chemray型，Rayto公司)；微型高速離心機(jī)(C2500-R-230V型，美國(guó)Labnet有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450型，日本ASONE有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan MK3型，Thermo scientific有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

40只Wistar大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量隨機(jī)選取10只大鼠作為空白組?？瞻捉M繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。剩余30只大鼠給予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)。高糖、高脂飼料喂養(yǎng)4周后禁食，不禁水12 h，稱取大鼠體質(zhì)量。高糖高脂組按35 mg/kg腹腔注射1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，空白組按同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：取2.1 g檸檬酸加入100 mL雙蒸水，配制成0.1 mmol/L A液，取2.94 g檸檬酸鈉加入100 mL雙蒸水，配制成0.1 mmol/L B液。取28 mL A液與22 mL B液混合，用雙蒸水定容至100 mL，用pH試紙測(cè)pH值為4.2～4.5，即為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，臨用前10 min配制。1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：取700 mg STZ 溶于40 mL上述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，即可配制成 1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，現(xiàn)用現(xiàn)配，配制過(guò)程防潮，配制后30 min內(nèi)用完。

STZ注射72 h后，所有大鼠禁食不禁水12 h，20%葡萄糖溶液按照2.0 g/kg劑量灌胃以測(cè) OGTT。斷尾法取血，One Touch強(qiáng)生血糖儀分別測(cè)該組大鼠空腹血糖(FBG)、OGTT后2 h血糖(2hBG)，酶聯(lián)免疫法測(cè)空腹胰島素(FINS)。取FBG≥7.8 mmol/L或血糖峰值≥16.7 mmol/L的大鼠為造模成功大鼠。本試驗(yàn)建模存活率為96%,穩(wěn)定成模率為75%。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將造模成功的大鼠采用高脂、高糖飼料并隨機(jī)分成復(fù)脾湯組10只、二甲雙胍組10只、模型組10只和正常組10只。造模2周后進(jìn)行藥物干預(yù)，模型組和正常組均用生理鹽水(每1 kg體質(zhì)量10 mL)灌胃；二甲雙胍組是用二甲雙胍懸浮液按每1 kg體質(zhì)量0.089 g灌胃；復(fù)脾湯組使用復(fù)脾湯煎劑，按每1 kg體質(zhì)量14.2 g的劑量灌胃。

2.3 標(biāo)本采集

用藥6周后，大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下用麻醉藥(20%烏拉坦)進(jìn)行腹腔麻醉,進(jìn)行主動(dòng)脈采血，采用離心機(jī)離心(3 000 r/min)20 min后，收取上清液，將上清液存于-80 ℃冰箱，待指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

采用生化法檢測(cè)FBG、2hBG、14dBG和TG；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(Elisa法)檢測(cè)LEP、INS、vaspin和Apelin指標(biāo)的表達(dá)。

2.5 檢測(cè)方法

2.5.1 FBG、2hBG、14dBG和TG檢測(cè)方法

采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.2 LEP、INS、vaspin和Apelin指標(biāo)檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。1)加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL。給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min。2)棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗體工作液100 μL(在使用前20 min內(nèi)配制)，給酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃溫育1 h。3)棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，大約350 μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。4)每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用前20 min內(nèi)配制，避光放置)100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min。5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 復(fù)脾湯對(duì)各組大鼠FBG、2hBG、14dBG和TG的影響

與對(duì)照組比較，治療后復(fù)脾湯組和二甲雙胍組FBG、2hBG、14dBG和TG指標(biāo)均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)脾湯組與二甲雙胍組比較，F(xiàn)BG、2hBG、14dBG和TG指標(biāo)均高于二甲雙胍組，兩組BG、2hBG、TG指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，14dBG指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3.2 復(fù)脾湯對(duì)各組大鼠INS的影響

與對(duì)照組比較，治療后復(fù)脾湯組和二甲雙胍組INS1升高，INS2表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復(fù)脾湯組INS1、INS2變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠INS的變化

3.3 復(fù)脾湯對(duì)各組大鼠LEP、Apelin、vaspin的影響

與對(duì)照組比較，復(fù)脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從復(fù)脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin表達(dá)情況比較，變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠LEP、Apelin、vaspin的變化

4 討論

糖尿病屬于“消渴”范疇。歷代醫(yī)家對(duì)消渴的研究認(rèn)為，病機(jī)以腎陰虛為本，燥熱為標(biāo)，分上、中、下三消論治[6]。消渴的發(fā)病雖與肺、脾、腎等多臟器失調(diào)相關(guān)，但其首發(fā)于脾胃，久則影響三焦，脾胃功能的失調(diào)是消渴發(fā)生、發(fā)展的重要因素[7]。脾、胃位中焦，兩臟燥濕相濟(jì)，陰陽(yáng)相合，升降相因相輔為用。脾胃為后天之本，氣血生化之源。脾主運(yùn)化、升清，胃主受納、腐熟水谷，共同完成飲食水谷的消化吸收。若脾失健運(yùn)，郁而化熱，則多食易饑[8]。脾虛不能散精，則肺失所養(yǎng)，肺陰不足，津液無(wú)以輸布則成干渴。脾為胃行其津液，若脾陰不足，胃火亢盛，則多飲多食。糖尿病患者雖多飲多食，但多形態(tài)消瘦，究其病因與脾體合肌肉，主四肢的功能失調(diào)相關(guān)[9]。若脾運(yùn)失健、肌肉失養(yǎng)而形體消瘦。脾胃虛弱，升清降濁失常，精微隨濁陰之氣下流而尿量增多，混濁如脂膏、味甜[10]。脾氣虧虛，健運(yùn)失職，“游溢”乏力，是糖尿病血糖升高及諸癥萌生的源泉。

復(fù)脾湯是根據(jù)脾虛“不及游溢”的消渴病基本病機(jī)，具有健脾和胃消積養(yǎng)陰之功用。方中多為藥食同源之中藥，無(wú)明顯不良反應(yīng)。方中人參味甘，有大補(bǔ)元?dú)?、生津止渴、調(diào)榮養(yǎng)衛(wèi)的功能；黃芪味甘，健脾益氣、扶正固本的功效；五味子酸澀，滋腎水、納元?dú)?，既能生津又可澀精的作用；山藥甘平，益氣養(yǎng)陰、生津止渴，能平補(bǔ)肺、脾、腎三臟之氣；麥冬具有生津潤(rùn)肺、養(yǎng)陰清熱的功能；葛根升清降濁、有生津化液止渴之功，能促進(jìn)營(yíng)津上升，精氣布散，鼓舞胃氣上行而生陰液；天花粉味甘性涼，養(yǎng)胃陰，瀉瘀火，善于清熱生津、消腫排膿，乃“消渴圣藥”；雞內(nèi)金消積滯、健脾胃。該方切合消渴病的基本病機(jī)，臨床療效顯著。

目前研究認(rèn)為，糖尿病的發(fā)病與胰島素缺乏或(和)胰島素作用障礙關(guān)系密切相關(guān)。胰島素功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等代謝紊亂，脂肪組織不再僅僅作為儲(chǔ)藏能量的人體組織，而在機(jī)體生命代謝也起關(guān)鍵性作用[11]。脂肪組織分泌的多種激素如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素及細(xì)胞因子等，能調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[12-15]。因此，本研究認(rèn)為糖尿病與糖脂代謝失衡關(guān)系密切。

瘦素(LEP)是由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，也是人體自身調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，并且對(duì)胰島素有雙向調(diào)節(jié)作用[16-17]。因此，LEP能調(diào)節(jié)血糖。Apelin和vaspin為一種新型脂肪因子，在脂肪組織中大量表達(dá)。Apelin與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，以及糖尿病抵抗等方面均有重要作用。目前研究認(rèn)為，糖尿病患者vaspin指標(biāo)的升高可能是胰島素水平降低的一種代償反應(yīng)，但其與糖代謝的關(guān)系然不明確[18]。本研究通過(guò)對(duì)STZ模型大鼠LEP、Apelin、vaspin指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：模型組、復(fù)脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin指標(biāo)均升高，與模型組比較，復(fù)脾湯組和二甲雙胍組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

目前研究認(rèn)為，糖尿病與肥胖的病理基礎(chǔ)相同，其疾病的發(fā)生與胰島素抵抗相關(guān)。因一些脂肪因子可促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)展，故成為目前研究的熱點(diǎn)。有研究[19]認(rèn)為，新型脂肪因子(Apelin、vaspin)可增加胰島素的敏感性。二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用藥物，有促進(jìn)胰島素分泌的作用[20]。因此本研究選用二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照組，結(jié)果表明，復(fù)脾湯與二甲雙胍對(duì)STZ模型大鼠均有較好的治療效果。復(fù)脾湯是中藥制劑，無(wú)二甲雙胍惡心、腹部不適、腹瀉皮疹、蕁麻疹等不良反應(yīng)。

本研究基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論“脾主散精”理論，以“脾虛不及游溢”為切入點(diǎn)，觀察具有健脾益氣功效的復(fù)脾湯對(duì)大鼠血糖、TG、INS、LEP及新型脂肪因子Apelin、vaspin血清水平的影響，以探明復(fù)脾湯治療糖尿病的生物學(xué)機(jī)制,并驗(yàn)證“脾主散精”理論，從而證實(shí)糖尿病患者存在“脾氣虛”的病理狀態(tài)，為中醫(yī)從脾論治糖尿病提供可靠依據(jù)。