黃天馬，李建香，顧恒，過偉峰*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210022)

腦出血屬于中風(fēng)范疇，占我國所有卒中發(fā)病率的10%～30%，急性期病死率、致殘率高，血腫形成后易繼發(fā)二次腦損害。臨床主要使用脫水、降顱壓及手術(shù)治療等治療，但效果均未達(dá)到預(yù)期[1]。國醫(yī)大師周仲瑛認(rèn)為,瘀血阻于腦絡(luò)，腦絡(luò)不通致蒙蔽清竅、火邪迫血妄行，灼傷腦絡(luò)，絡(luò)破而血溢出脈外，兩者合而為病，基于此創(chuàng)制了涼血通瘀方治療急性腦出血，以通腑瀉熱、涼血散瘀為治療方法。通腑瀉熱法體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“上病下取”“腦病治腸”的理念[2]。

顱內(nèi)血腫形成后，炎癥反應(yīng)貫穿了腦出血發(fā)展的所有階段[3]。本實驗采用涼血通瘀方干預(yù)腦出血大鼠模型，從行為學(xué)評分的改變、涼血通瘀方對炎性因子TNF-α、IL-1β及NF-κB通路的影響，探討涼血通瘀方的抗炎作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(浙)20140001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，5只/籠，12 h/12 h光暗交替，恒溫恒濕。適用性飼養(yǎng)1周，自由飲水?dāng)z食。本實驗方案由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核(201805A026)通過。

1.2 藥物

涼血通瘀方：大黃10 g，水牛角30 g，生地黃20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g。以上中藥材由安徽滬春堂中藥飲片有限公司一次性購入，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院制劑室煎制。常規(guī)方法水煎過濾、加水復(fù)煎過濾，合并2次濾液，濃縮至每毫升含生藥1.2 g。

1.3 主要試劑及儀器

大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-1β ELISA試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠NF-κB p65抗體(美國Cell Signaling公司)；10%水合氯醛(上海麥克林生化科技有限公司)；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù))。

腦立體定位儀(成都泰盟軟件有限公司)；注射泵控制器(保定蘭格恒流泵有限公司)；生物顯微鏡(德國Leica公司)；微量進(jìn)樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)。

2 方法

2.1 實驗動物建模及分組

對大鼠稱體質(zhì)量并編號，采用改良注射泵控制器注血/二次退針法[4]，制備大鼠腦出血模型；造模完成后，待大鼠蘇醒，使用Longa評分法評估大鼠，選擇1～3分的大鼠納入造模合格標(biāo)準(zhǔn)。

選取正常大鼠15只作為正常組，45只符合造模合格標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(開顱后僅插入進(jìn)樣器但針頭不注血)、模型組、涼血通瘀組(造模完成3 h后開始灌胃用藥，給藥量為1.3 mL/100 g體質(zhì)量，每日灌胃1次，連續(xù)5日)。上述4組大鼠，每組設(shè)立用藥后24 h、72 h、120 h 3個時間點，每個時間點5只。

2.2 行為學(xué)評分

采用Longa五級評分法[5]，記錄大鼠行為學(xué)評分改變。標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Longa五級評分法行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 ELISA法檢測腦組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)

實驗完成后，對腦出血大鼠進(jìn)行取材，將每組各時間點的大鼠腦組織進(jìn)行取樣，并進(jìn)行處理后保存?zhèn)溆?。取檢測腦組織TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒按照說明書進(jìn)行操作。在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處吸光度(OD值)，按照公式計算樣本濃度。

2.4 免疫組化法檢測NF-κB p65表達(dá)

將經(jīng)過處理的組織石蠟切片脫蠟水化、修復(fù)抗原后，使用山羊血清進(jìn)行封閉并孵育過夜。經(jīng)DAB顯色于顯微鏡下觀察，使用蘇木素復(fù)染后脫水、中性樹膠封片。切片使用生物顯微鏡觀察，每張切片挑選5張背景光一致的200倍視野照片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，根據(jù)公式求取平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)評分比較

統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠在所有時間點的行為學(xué)評分均為0。模型組大鼠在3個時間點均出現(xiàn)了神經(jīng)功能損害現(xiàn)象，程度不一。與假手術(shù)組比，P均<0.05。涼血通瘀組大鼠在72 h時間點行為學(xué)評分已明顯低于模型組(P<0.05)，并持續(xù)降低。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點行為學(xué)評分比較分)

3.2 炎癥因子TNF-α、IL-1β的ELISA測定結(jié)果比較

相比于假手術(shù)組，模型組腦組織TNF-α在3個時間點均升高(P<0.01)；相比于模型組，涼血通瘀組腦組織TNF-α在3個時間點均降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠在不同時間點腦組織TNF-α水平比較

在全部3個時間點，模型組腦組織IL-1β均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組在3個時間點均明顯低于模型組(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠在不同時間點腦組織IL-1β水平比較

3.3 免疫組化測定NF-κB p65結(jié)果比較

在24 h時間點，模型組大鼠NF-κB p65明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組高于假手術(shù)組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；在72 h時間點，模型組顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，低于模型組(P<0.01)；在120 h時間點，模型組顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，低于模型組(P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠在不同時間點NF-κB p65水平比較

4 討論

在腦出血的發(fā)生及病情發(fā)展變化中，炎性反應(yīng)可貫穿于腦出血整個病理過程的各個階段。腦出血發(fā)生后，可引起多種細(xì)胞因子的分泌，而其中某些因子被證實為生物標(biāo)志物，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[6]。這些因子可以直接或者間接的參與到腦出血后病理過程的炎癥反應(yīng)中，近年來成為研究熱點之一。

作為NF-κB家族重要成員之一的p65受到刺激后活化，進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)眾多細(xì)胞因子的表達(dá)[7]，不斷促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。在大量分泌的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β的刺激下，巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞被持續(xù)激活，從而導(dǎo)致了血腦屏障通透性的破壞，再次加重腦水腫，腦的繼發(fā)性損害不斷持續(xù)上升。炎性反應(yīng)在腦損害-神經(jīng)功能受損-繼發(fā)性腦損害的惡性循環(huán)中級聯(lián)放大[8]。

腦出血發(fā)生以后，NF-κB通路的活化、刺激TNF-α、IL-1β的大量分泌是繼發(fā)性腦損害的罪魁禍?zhǔn)字弧Ｈ绾谓档?、防治腦出血后的繼發(fā)性腦損害成為了近年來國內(nèi)外的研究熱點，而中醫(yī)藥治療腦出血在臨床實踐中取得了良好的療效，通過中醫(yī)藥治療是否可調(diào)控NF-κB的活化，成為了新的研究思路與方法。

本實驗選取了國醫(yī)大師周仲瑛所創(chuàng)的涼血通瘀方，使用該方干預(yù)腦出血大鼠模型，選取行為學(xué)評分作為腦神經(jīng)功能損害指標(biāo)，并測定腦組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β的表達(dá)，從炎癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制探尋涼血通瘀方在腦出血大鼠模型中的抗炎作用。實驗結(jié)果揭示了使用涼血通瘀方24 h后，持續(xù)降低NF-κB p65的表達(dá)，NF-κB通路活性降低，TNF-α、IL-1β的含量顯著低于模型組，證實了涼血通瘀方通過抑制NF-KκB通路的活化，降低TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，減少損害性炎癥發(fā)生，改善了腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮了抗炎作用。

綜上所述，涼血通瘀方能夠調(diào)控腦出血大鼠NF-κB通路活化、抑制炎性因子的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生、降低炎癥的級聯(lián)放大效應(yīng)，改善了腦出血大鼠的行為學(xué)評分，發(fā)揮抗炎作用。本實驗依托于名老中醫(yī)的有效驗方，結(jié)合當(dāng)前新的研究思路與方法，為本方的作用機(jī)制提出了新的科學(xué)解釋。