胡靈燕，張旗，蔡淑美，張爍，馮燕婷，陳玲凡，辛志明*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福建省新藥安全性評(píng)價(jià)中心，福建 福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，福建 福州 350122；3.福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)部，福建 福州 350122)

焦慮癥的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要精神疾病之一(約占11.4%)[1-2]，給社會(huì)和個(gè)人都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。藥物治療是目前干預(yù)焦慮癥的主要手段之一，其中最為常用的藥物是苯二氮卓類(BZDs)和選擇性 5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)[3]，但由于其副作用和起效慢等不足在臨床應(yīng)用中受到限制[4-6]，因此亟待研發(fā)安全有效的抗焦慮藥物。從傳統(tǒng)中藥尋找抗焦慮的活性成分并深入進(jìn)行相關(guān)的關(guān)鍵科學(xué)問題探索研究是創(chuàng)制新型抗焦慮藥物的重要途徑。

開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》卷十四“小腸腑·風(fēng)虛驚悸第六”，方劑組成為“石菖蒲遠(yuǎn)志各二兩，茯苓人參各三兩”，主治“主心氣不定，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝瘥暮劇，狂眩方”，是治療中醫(yī)情志病的經(jīng)典方[7]。后世醫(yī)家主要用開心散治療心氣不足、神志不寧、健忘失眠、心怯怔忡等證，即西醫(yī)范疇的抑郁、焦慮癥狀、學(xué)習(xí)記憶障礙等[8]，可見開心散主要用于精神性疾病的治療。近年來，開心散對(duì)精神性疾病治療的研究主要集中于抗抑郁和改善老年癡呆癥的研究，而開心散對(duì)焦慮障礙的治療作用尚未闡明。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

開心散中成分人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲(北京同仁堂藥店)；地西泮(規(guī)格：2 mL/10 mg，天津金耀藥業(yè)有限公司)；5-HT試劑盒(批號(hào)：C0101070172，武漢華美生物工程有限公司)；色譜乙腈(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(Waters 公司)；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)，ZORBAX SB-Aq(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高效液相色譜串聯(lián)二維線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap XL型(美國賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

開心散(KXS)：人參18 g，茯苓18 g，遠(yuǎn)志12 g，石菖蒲12 g。10 倍量60% 乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得復(fù)方的提取物，濃度為0.9 g/mL。

2.2 開心散提取物抗焦慮作用

將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組,陽性藥組(地西泮1 mg/kg),開心散(KXS)的高劑量(12 g/kg)、中劑量(6 g/kg)、低劑量(3 g/kg)組。將每只大鼠放在電擊儀(30 cm× 24 cm×21 cm)中適應(yīng)5 min。隨后，以30 s的間隔持續(xù)刺激2 s，連續(xù)10次進(jìn)行選擇性足底震擊(0.5 mA)[9]，連續(xù)刺激7 d后，各組大鼠給藥7 d后進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)試和曠場(chǎng)試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的中央?yún)^(qū)滯留距離作為評(píng)價(jià)藥物抗焦慮作用的指標(biāo)；并用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)大鼠腦組織5-HT的含量進(jìn)行測(cè)定，以探討其抗焦慮作用情況。

2.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

灌胃給藥第7 d，給藥1 h后進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先將大鼠置于開場(chǎng)中活動(dòng)5 min，然后將大鼠置于迷宮中央，使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開放臂，用計(jì)算機(jī)跟蹤記錄大鼠在高架十字迷宮上的活動(dòng)情況，記錄時(shí)間為5 min。以大鼠的開臂次數(shù)百分比(OE%)即開臂次數(shù)/(開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))和開臂滯留時(shí)間百分比(OT%)即開臂滯留時(shí)間/(開臂時(shí)間+閉臂時(shí)間)作為評(píng)價(jià)藥物抗焦慮作用的指標(biāo)[10]。

2.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)采用四聯(lián)立方體木敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)，周壁與底面為黑色，底面分為中央?yún)^(qū)與外周區(qū)且兩區(qū)域面積相同。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)開始前5 min將大鼠移至測(cè)試區(qū)以適應(yīng)陌生的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠置于礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中央，然后開始計(jì)時(shí)，每組5 min。通過安置的攝像監(jiān)測(cè)系統(tǒng)以及計(jì)算機(jī)安裝的動(dòng)物行為學(xué)軟件記錄其在5 min內(nèi)滯留于中央?yún)^(qū)的距離百分比[11]。

2.2.3 腦組織取材

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，各組大鼠(2%戊巴比妥鈉，40 mg/kg)麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，立即斷頭，迅速取出大腦，用冰生理鹽水沖洗除去血液，濾紙拭干，快速在冰盤上分離出海馬組織，放入勻漿器中加生理鹽水冰浴中磨成勻漿液，4 ℃高速離心20 min(離心速率為18 000 r/min)，取上清液放-80 ℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

2.2.4 海馬組織中5-HT水平的測(cè)定

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠5-羥色胺(5-HT)水平。往預(yù)先包被5-HT和NE 抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒的包被微孔中，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸性終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的5-HT含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定樣品的吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度，具體操作參照ELISA說明書步驟。數(shù)據(jù)用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用單因素方差分析。

2.3 開心散提取物的色譜條件

精密稱量開心散提取物0.129 4 g，用甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶，得到濃度為12.94 mg/mL開心散的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～5 min，3% A；5～7 min，3～8% A；7～10 min，8% A；10～17 min，8～15% A；17～20 min，15～18% A；20～25 min，18～25% A；25～28 min，25～30% A；28～32 min，30% A；32～36 min，30～32% A；36～37 min，32～40% A；37～42 min，40～48% A；42～50 min，48～80% A；50～52 min，80～85% A；52～58 min，85 A。流速：0.3 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：254 nm。

2.4 開心散提取物的質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀。電離參數(shù)設(shè)置如下：負(fù)離子模式；方法設(shè)置如下：鞘氣(氮?dú)?流量為30 arb，輔助氣體(氮?dú)?流量為5 arb，噴霧電壓4.0 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為25 V。掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描了m/z 200～2 000的質(zhì)量范圍。將碰撞誘導(dǎo)解離(CID)的碰撞能量調(diào)整為最大強(qiáng)度峰的30%，前體離子的分離寬度為m/z 2.0 Da。啟用了動(dòng)態(tài)排除以防止重復(fù)，并且將重復(fù)計(jì)數(shù)設(shè)置為5，動(dòng)態(tài)重復(fù)時(shí)間為30 s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60 s。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有數(shù)據(jù)，對(duì)于各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P≤0.05作為評(píng)定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。利用Thermo Xcalibur軟件解析其化合物，鑒定時(shí)，綜合對(duì)比化合物的歸屬、母離子、子離子的信息，并參考相關(guān)研究的文獻(xiàn)，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 開心散(KXS)提取物對(duì)大鼠焦慮行為的影響

高架十字迷宮結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性組地西泮能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間OE%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物高劑量組(12 g/kg)和中劑量(6 g/kg)能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間OE%值(P<0.05)，顯示出開心散提取物高劑量、中劑量對(duì)大鼠的抗焦慮作用，尤其以開心散提取物高劑量的抗焦慮作用更為明顯。與對(duì)照組相比，開心散提取物低劑量組(3 g/kg)開臂時(shí)間百分比也增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，與對(duì)照組相比，地西泮和KXS提取物(12、6和3 g/kg)能夠顯著提高大鼠的開臂次數(shù)(P<0.05)。同時(shí)，表明KXS具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，見表1。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，地西泮能提高大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的距離OD%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物組能增加大鼠在中心區(qū)域的距離OD%值，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

3.2 大鼠海馬5-HT檢測(cè)結(jié)果

5-HT檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，地西泮組與開心散給藥組(3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg)能夠顯著升高大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量，尤其高、中劑量組的升高程度最顯著(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表1。說明開心散提取物組能夠顯著提高焦慮模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量，證實(shí)其具有較好的抗焦慮作用。

表1 開心散干預(yù)大鼠焦慮模型情況比較

3.3 開心散提取物的成分分析

通過摸索得到的洗脫條件，建立了開心散提取物在254 nm下的色譜圖(見圖1)以及UPLC-DAD-ESI-MSn總離子流圖(見圖2)。根據(jù)質(zhì)譜裂解信息以及文獻(xiàn)對(duì)比[12-15]，共解析圖譜得到39個(gè)化合物，包括11個(gè)遠(yuǎn)志皂苷類化合物，12個(gè)遠(yuǎn)志寡糖酯類化合物，3個(gè)蔗糖酯化合物，3個(gè)遠(yuǎn)志酮化合物，3個(gè)人參皂苷類化合物，7個(gè)三萜烯酸類化合物，分別為西伯利亞糖A5、西伯利亞糖A1、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、sibiricaxanthone A、7-O-methylmangiferin、polygalaxanthone Ⅲ、3,6′-二芥子?；崽?、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、Tenuifoliose L、Tenuifoliose F、Tenuifoliose K、Tenuifoliose C、Tenuifoliside C、Tenuifoliose J or I、Tenuifolise B、Tenuifoliose H、Tenuifoliose A、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Ro、Ginsenoside Rd2、Senegin IV、Onjisaponin O、Onjisaponin L、Senegin Ⅲ、Onjisaponin R、Polygalasaponin XXXⅡ、Onjisaponin E、Onjisaponin F、onjisaponin G、onjisaponin Gg、onjisaponin W、poricoic acid H、3β-p-hydroxybenzoyldehydrotumulosic acid、16α-hydroxytrametenolic acid、tumulosic acid、poricoic acid C、3β-hydroxy-16α-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、3-epi-dehydropachymic acid。

圖1 開心散提取物的UPLC色譜圖

圖2 開心散提取物UPLC-MS-MSn總離子流圖

4 討論

開心散始載于唐代孫思邈的《備急千金要方》，用于治療失眠，精神障礙和病態(tài)健忘。研究表明，開心散可以通過增加MT1表達(dá)和增加BDNF表達(dá)來改善抑郁樣行為[16]。然而，開心散提取物抗焦慮作用以及機(jī)制研究尚未闡明。本課題選用被廣泛用于評(píng)估嚙齒動(dòng)物焦慮相關(guān)行為的高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明開心散提取物(12 g/kg和6 g/kg)改善了焦慮樣行為，表現(xiàn)為能夠顯著增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間百分比和開臂次數(shù)(P<0.05)，以及能夠相應(yīng)增加大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中央?yún)^(qū)域距離。此外，開心散提取物(12 g/kg，6 g/kg和3 g/kg)可以顯著上調(diào)海馬5-HT水平(P<0.05)，并呈劑量依賴性。長期以來，5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)參與了焦慮的調(diào)解，5-HT也是現(xiàn)有抗焦慮藥物的主要目標(biāo)[17]?？傊琄XS提取物可能通過其5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)改變了這些行為障礙而具有抗焦慮作用。

為了探索開心散提取物的藥效成分，筆者建立了UPLC色譜圖。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步通過UPLC-DAD-ESI-MSn并對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了39個(gè)化學(xué)成分，包括11個(gè)遠(yuǎn)志皂苷類化合物，12個(gè)遠(yuǎn)志寡糖酯類化合物，3個(gè)蔗糖酯化合物，3個(gè)遠(yuǎn)志酮化合物，3個(gè)人參皂苷類化合物，7個(gè)三萜烯酸類化合物。在先前的研究基礎(chǔ)上[12]，筆者進(jìn)一步鑒定出7種三萜酸。原因可能是本研究中開心散提取物是用60%乙醇提取的，而三萜酸更易被提取。此外，據(jù)報(bào)道人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷等具有抗焦慮作用或抗抑郁作用[18]。