胡靈燕，張旗，蔡淑美，張爍，馮燕婷，陳玲凡，辛志明*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福建省新藥安全性評價(jià)中心，福建 福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，福建 福州 350122；3.福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)部，福建 福州 350122)

焦慮癥的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要精神疾病之一(約占11.4%)[1-2]，給社會和個(gè)人都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。藥物治療是目前干預(yù)焦慮癥的主要手段之一，其中最為常用的藥物是苯二氮卓類(BZDs)和選擇性 5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)[3]，但由于其副作用和起效慢等不足在臨床應(yīng)用中受到限制[4-6]，因此亟待研發(fā)安全有效的抗焦慮藥物。從傳統(tǒng)中藥尋找抗焦慮的活性成分并深入進(jìn)行相關(guān)的關(guān)鍵科學(xué)問題探索研究是創(chuàng)制新型抗焦慮藥物的重要途徑。

開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》卷十四“小腸腑·風(fēng)虛驚悸第六”，方劑組成為“石菖蒲遠(yuǎn)志各二兩，茯苓人參各三兩”，主治“主心氣不定，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝瘥暮劇，狂眩方”，是治療中醫(yī)情志病的經(jīng)典方[7]。后世醫(yī)家主要用開心散治療心氣不足、神志不寧、健忘失眠、心怯怔忡等證，即西醫(yī)范疇的抑郁、焦慮癥狀、學(xué)習(xí)記憶障礙等[8]，可見開心散主要用于精神性疾病的治療。近年來，開心散對精神性疾病治療的研究主要集中于抗抑郁和改善老年癡呆癥的研究，而開心散對焦慮障礙的治療作用尚未闡明。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

開心散中成分人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲(北京同仁堂藥店)；地西泮(規(guī)格：2 mL/10 mg，天津金耀藥業(yè)有限公司)；5-HT試劑盒(批號：C0101070172，武漢華美生物工程有限公司)；色譜乙腈(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(Waters 公司)；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)，ZORBAX SB-Aq(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高效液相色譜串聯(lián)二維線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap XL型(美國賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

開心散(KXS)：人參18 g，茯苓18 g，遠(yuǎn)志12 g，石菖蒲12 g。10 倍量60% 乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得復(fù)方的提取物，濃度為0.9 g/mL。

2.2 開心散提取物抗焦慮作用

將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組,陽性藥組(地西泮1 mg/kg),開心散(KXS)的高劑量(12 g/kg)、中劑量(6 g/kg)、低劑量(3 g/kg)組。將每只大鼠放在電擊儀(30 cm× 24 cm×21 cm)中適應(yīng)5 min。隨后，以30 s的間隔持續(xù)刺激2 s，連續(xù)10次進(jìn)行選擇性足底震擊(0.5 mA)[9]，連續(xù)刺激7 d后，各組大鼠給藥7 d后進(jìn)行高架十字迷宮測試和曠場試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比以及曠場實(shí)驗(yàn)中的中央?yún)^(qū)滯留距離作為評價(jià)藥物抗焦慮作用的指標(biāo)；并用酶聯(lián)免疫吸附法對大鼠腦組織5-HT的含量進(jìn)行測定，以探討其抗焦慮作用情況。

2.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

灌胃給藥第7 d，給藥1 h后進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先將大鼠置于開場中活動5 min，然后將大鼠置于迷宮中央，使其頭部正對其中一個(gè)開放臂，用計(jì)算機(jī)跟蹤記錄大鼠在高架十字迷宮上的活動情況，記錄時(shí)間為5 min。以大鼠的開臂次數(shù)百分比(OE%)即開臂次數(shù)/(開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))和開臂滯留時(shí)間百分比(OT%)即開臂滯留時(shí)間/(開臂時(shí)間+閉臂時(shí)間)作為評價(jià)藥物抗焦慮作用的指標(biāo)[10]。

2.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)采用四聯(lián)立方體木敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)，周壁與底面為黑色，底面分為中央?yún)^(qū)與外周區(qū)且兩區(qū)域面積相同。曠場實(shí)驗(yàn)開始前5 min將大鼠移至測試區(qū)以適應(yīng)陌生的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠置于礦場實(shí)驗(yàn)中央，然后開始計(jì)時(shí)，每組5 min。通過安置的攝像監(jiān)測系統(tǒng)以及計(jì)算機(jī)安裝的動物行為學(xué)軟件記錄其在5 min內(nèi)滯留于中央?yún)^(qū)的距離百分比[11]。

2.2.3 腦組織取材

行為學(xué)測試結(jié)束后，各組大鼠(2%戊巴比妥鈉，40 mg/kg)麻醉后，腹主動脈取血，立即斷頭，迅速取出大腦，用冰生理鹽水沖洗除去血液，濾紙拭干，快速在冰盤上分離出海馬組織，放入勻漿器中加生理鹽水冰浴中磨成勻漿液，4 ℃高速離心20 min(離心速率為18 000 r/min)，取上清液放-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

2.2.4 海馬組織中5-HT水平的測定

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測大鼠5-羥色胺(5-HT)水平。往預(yù)先包被5-HT和NE 抗體的ELISA檢測試劑盒的包被微孔中，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸性終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的5-HT含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定樣品的吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度，具體操作參照ELISA說明書步驟。數(shù)據(jù)用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用單因素方差分析。

2.3 開心散提取物的色譜條件

精密稱量開心散提取物0.129 4 g，用甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶，得到濃度為12.94 mg/mL開心散的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～5 min，3% A；5～7 min，3～8% A；7～10 min，8% A；10～17 min，8～15% A；17～20 min，15～18% A；20～25 min，18～25% A；25～28 min，25～30% A；28～32 min，30% A；32～36 min，30～32% A；36～37 min，32～40% A；37～42 min，40～48% A；42～50 min，48～80% A；50～52 min，80～85% A；52～58 min，85 A。流速：0.3 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.4 開心散提取物的質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀。電離參數(shù)設(shè)置如下：負(fù)離子模式；方法設(shè)置如下：鞘氣(氮?dú)?流量為30 arb，輔助氣體(氮?dú)?流量為5 arb，噴霧電壓4.0 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為25 V。掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描了m/z 200～2 000的質(zhì)量范圍。將碰撞誘導(dǎo)解離(CID)的碰撞能量調(diào)整為最大強(qiáng)度峰的30%，前體離子的分離寬度為m/z 2.0 Da。啟用了動態(tài)排除以防止重復(fù)，并且將重復(fù)計(jì)數(shù)設(shè)置為5，動態(tài)重復(fù)時(shí)間為30 s，動態(tài)排除時(shí)間為60 s。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有數(shù)據(jù)，對于各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P≤0.05作為評定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。利用Thermo Xcalibur軟件解析其化合物，鑒定時(shí)，綜合對比化合物的歸屬、母離子、子離子的信息，并參考相關(guān)研究的文獻(xiàn)，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 開心散(KXS)提取物對大鼠焦慮行為的影響

高架十字迷宮結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性組地西泮能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間OE%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物高劑量組(12 g/kg)和中劑量(6 g/kg)能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間OE%值(P<0.05)，顯示出開心散提取物高劑量、中劑量對大鼠的抗焦慮作用，尤其以開心散提取物高劑量的抗焦慮作用更為明顯。與對照組相比，開心散提取物低劑量組(3 g/kg)開臂時(shí)間百分比也增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，與對照組相比，地西泮和KXS提取物(12、6和3 g/kg)能夠顯著提高大鼠的開臂次數(shù)(P<0.05)。同時(shí)，表明KXS具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，見表1。

曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，地西泮能提高大鼠進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)域的距離OD%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物組能增加大鼠在中心區(qū)域的距離OD%值，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

3.2 大鼠海馬5-HT檢測結(jié)果

5-HT檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，地西泮組與開心散給藥組(3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg)能夠顯著升高大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量，尤其高、中劑量組的升高程度最顯著(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表1。說明開心散提取物組能夠顯著提高焦慮模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量，證實(shí)其具有較好的抗焦慮作用。

表1 開心散干預(yù)大鼠焦慮模型情況比較

3.3 開心散提取物的成分分析

通過摸索得到的洗脫條件，建立了開心散提取物在254 nm下的色譜圖(見圖1)以及UPLC-DAD-ESI-MSn總離子流圖(見圖2)。根據(jù)質(zhì)譜裂解信息以及文獻(xiàn)對比[12-15]，共解析圖譜得到39個(gè)化合物，包括11個(gè)遠(yuǎn)志皂苷類化合物，12個(gè)遠(yuǎn)志寡糖酯類化合物，3個(gè)蔗糖酯化合物，3個(gè)遠(yuǎn)志酮化合物，3個(gè)人參皂苷類化合物，7個(gè)三萜烯酸類化合物，分別為西伯利亞糖A5、西伯利亞糖A1、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、sibiricaxanthone A、7-O-methylmangiferin、polygalaxanthone Ⅲ、3,6′-二芥子?；崽恰enuifoliose G、Tenuifoliside A、Tenuifoliose L、Tenuifoliose F、Tenuifoliose K、Tenuifoliose C、Tenuifoliside C、Tenuifoliose J or I、Tenuifolise B、Tenuifoliose H、Tenuifoliose A、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Ro、Ginsenoside Rd2、Senegin IV、Onjisaponin O、Onjisaponin L、Senegin Ⅲ、Onjisaponin R、Polygalasaponin XXXⅡ、Onjisaponin E、Onjisaponin F、onjisaponin G、onjisaponin Gg、onjisaponin W、poricoic acid H、3β-p-hydroxybenzoyldehydrotumulosic acid、16α-hydroxytrametenolic acid、tumulosic acid、poricoic acid C、3β-hydroxy-16α-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、3-epi-dehydropachymic acid。

圖1 開心散提取物的UPLC色譜圖

圖2 開心散提取物UPLC-MS-MSn總離子流圖

4 討論

開心散始載于唐代孫思邈的《備急千金要方》，用于治療失眠，精神障礙和病態(tài)健忘。研究表明，開心散可以通過增加MT1表達(dá)和增加BDNF表達(dá)來改善抑郁樣行為[16]。然而，開心散提取物抗焦慮作用以及機(jī)制研究尚未闡明。本課題選用被廣泛用于評估嚙齒動物焦慮相關(guān)行為的高架十字迷宮和曠場實(shí)驗(yàn)作為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明開心散提取物(12 g/kg和6 g/kg)改善了焦慮樣行為，表現(xiàn)為能夠顯著增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時(shí)間百分比和開臂次數(shù)(P<0.05)，以及能夠相應(yīng)增加大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)的中央?yún)^(qū)域距離。此外，開心散提取物(12 g/kg，6 g/kg和3 g/kg)可以顯著上調(diào)海馬5-HT水平(P<0.05)，并呈劑量依賴性。長期以來，5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)參與了焦慮的調(diào)解，5-HT也是現(xiàn)有抗焦慮藥物的主要目標(biāo)[17]?？傊?，KXS提取物可能通過其5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)改變了這些行為障礙而具有抗焦慮作用。

為了探索開心散提取物的藥效成分，筆者建立了UPLC色譜圖。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步通過UPLC-DAD-ESI-MSn并對比相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了39個(gè)化學(xué)成分，包括11個(gè)遠(yuǎn)志皂苷類化合物，12個(gè)遠(yuǎn)志寡糖酯類化合物，3個(gè)蔗糖酯化合物，3個(gè)遠(yuǎn)志酮化合物，3個(gè)人參皂苷類化合物，7個(gè)三萜烯酸類化合物。在先前的研究基礎(chǔ)上[12]，筆者進(jìn)一步鑒定出7種三萜酸。原因可能是本研究中開心散提取物是用60%乙醇提取的，而三萜酸更易被提取。此外，據(jù)報(bào)道人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷等具有抗焦慮作用或抗抑郁作用[18]。