朱亞清， 李春輝*， 何 濤， 劉寧寧

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科， 河北 承德 067000 2.河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。我國(guó)每年胃癌的新發(fā)病例可達(dá)世界新發(fā)病例的40%以上[2]。臨床多數(shù)患者就診時(shí)已屬進(jìn)展期乃至晚期，手術(shù)無(wú)法根治，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，靶向治療和聯(lián)合靶向治療已成為提高腫瘤患者生存率的一個(gè)受關(guān)注的研究方向[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ANP對(duì)肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)的作用[4]。在胃組織上也存在ANP受體。迄今關(guān)于ANP對(duì)胃癌細(xì)胞的影響以及其潛在分子機(jī)制尚未有詳細(xì)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬探討ANP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的體外作用和聯(lián)合PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的體外作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料：低分化人類胃癌細(xì)胞株MGC-803由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng)；RPMI1640培養(yǎng)基(Corning)；胎牛血清(Cegrogen)；PBS(BI)；胰蛋白酶(Gibco)；ANP(Aladdin)；LY294002(Cayman)；CCK-8(美侖)；兔抗人Akt1/2/3 (Huananbio)；兔抗人P-Akt(ser473)(Affinity Biosciences)；兔抗人β-actin一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司；廣譜marker、BCA試劑盒、RIPA(附PMSF)、Westen Blot膜再生液均購(gòu)自Solarbio；超敏ECL液(大連美侖)；SDS-PAGED蛋白上樣緩沖液(貝博)等。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，1～2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%及以上時(shí)，1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2溶液的配置:LY294002溶液的配置325μL DMSO溶液充分溶解5mg LY294002干粉，配成50mmoL/L的LY294002溶液，分裝，-20℃保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋成特定的濃度。ANP溶液的配置 1623μL無(wú)菌超純水充分溶解500μg的ANP干粉，配成10～4moL/L的ANP溶液，分裝，-20℃保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋成特定的濃度。

1.2.3CCK-8法:檢測(cè)ANP對(duì)細(xì)胞增殖的影響：張佳[5]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較高濃度ANP(10-6、10-7moL/L)對(duì)胃癌細(xì)胞AGC增殖有抑制作用，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同濃度的ANP組(10-5、10-6、10-7moL/L)1.2.1傳代細(xì)胞以4×104/mL的密度均勻接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h，棄去舊的培養(yǎng)基，向96孔板中加入ANP儲(chǔ)備液處理MGC-803細(xì)胞，使終濃度分別為10-5、10-6、10-7moL/L，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)選定6個(gè)孔設(shè)為對(duì)照組(含細(xì)胞和培養(yǎng)基)，另設(shè)6個(gè)空白孔(只含培養(yǎng)基，扣除培養(yǎng)基本身的OD值)。分別在培養(yǎng)12、24和48h后，用CCK-8試劑盒，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。檢測(cè)LY294002對(duì)細(xì)胞的增殖的影響：設(shè)置對(duì)照組(只含細(xì)胞和培養(yǎng)基)和不同濃度的LY294002組(10、20、30、40、50μmoL/L)。種板方法同上，培養(yǎng)24h后，按照分組換上完全培養(yǎng)基和不同濃度的LY294002完全培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)24h、48h和72h后，用CCK-8試劑盒，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

分別計(jì)算ANP、LY294002對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。

依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果選細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在30%～50%的10-5moL/L ANP，30μmoL/L LY294002行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。方法同上，檢測(cè)各組作用48h后各孔的吸光度(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，求得各組平均細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.2.4觀察MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu):設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細(xì)胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中，2mL/孔，培養(yǎng)24h，棄舊培養(yǎng)基，根據(jù)分組分別加入完全培養(yǎng)基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，觀察各組MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化并拍照。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):在6孔板背后每隔0.5～1cm橫穿過(guò)孔劃5條平行線。設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細(xì)胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中，2mL/孔，培養(yǎng)24h，細(xì)胞單層貼壁90%以上匯合度，移液槍頭垂直于孔板背后的橫線做劃痕，PBS洗滌3次，洗去劃下的細(xì)胞，根據(jù)分組加入無(wú)血清培養(yǎng)基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的無(wú)血清培養(yǎng)基，2mL/孔。分別在培養(yǎng)0、24h取樣，拍照，記錄細(xì)胞遷移情況，Image J分析計(jì)算劃痕面積。計(jì)算各組劃痕面積修復(fù)率(%)=[劃痕創(chuàng)傷面積(0h)-劃痕創(chuàng)傷面積(24h)]/劃痕創(chuàng)傷面積(0h)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

1.2.6Western Blotting:同1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，將6孔板置于冰上，PBS洗滌3次，吸凈PBS，100μL/孔裂解液，冰上裂解60min，將細(xì)胞全部刮下轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃，12000 r/min，15min取出EP管，移取上清至新的EP管中，并作好標(biāo)記，行BCA蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST洗滌1次，5%脫脂奶粉常溫封閉2h，TBST洗滌2次，一抗4℃孵育過(guò)夜(t-Akt、P-Akt、β-actin工作濃度分別為1∶1000、1∶1000、1∶3000)，TBST洗滌3次，二抗搖床上孵育2h，TBST洗滌3次，ECL試劑顯影，凝膠成像儀拍照，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。不同批次蛋白重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

表1 各組大鼠免疫組化結(jié)果(OD值)

2.1CCK8結(jié)果ANP，LY294002及ANP聯(lián)合LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的影響:ANP和LY294002對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈時(shí)間-劑量依賴性,見表1，2。與ANP組和LY294002組相比，ANP聯(lián)合LY294002應(yīng)用對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng),見表3。

表2 不同濃度的LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

表3 ANP聯(lián)合LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

2.2MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化:顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MGC-803細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好；與對(duì)照組比較，ANP組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目減少，狀態(tài)稍差；LY294002組細(xì)胞與對(duì)照組比較，生長(zhǎng)嚴(yán)重受限，表現(xiàn)為部分細(xì)胞回縮甚至破裂懸浮狀態(tài)；(ANP+LY294002)組與二者單獨(dú)應(yīng)用組比較MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)受限更顯著，細(xì)胞碎裂并出現(xiàn)異常細(xì)胞形態(tài)。見圖1。

圖1 MGC-803細(xì)胞形態(tài)的改變(×200)

2.3劃痕結(jié)果:與對(duì)照組比較，ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細(xì)胞劃痕愈合速度減慢，且ANP+LY294002組劃痕愈合速度最慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3，圖2。

表3 ANP和LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力變化

2.4對(duì)MGC-803細(xì)胞中t-Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細(xì)胞p-Akt表達(dá)明顯降低，且ANP+LY294002組細(xì)胞p-Akt表達(dá)降低最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四組間細(xì)胞t-AKT蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4、圖3。

表4 細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量

圖3 免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

胃癌的發(fā)生與細(xì)胞的異常分化、增殖及遷移等密切相關(guān)，所以在胃癌的治療過(guò)程中抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移很重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ANP可抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖，并和濃度和作用時(shí)間相關(guān)。劃痕實(shí)驗(yàn)，10-5moL/L ANP作用于MGC-803細(xì)胞與對(duì)照組比較，劃痕的愈合速度變慢，這就揭示ANP可抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲力。本文研究結(jié)果表明ANP可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。ANP主要由心房肌細(xì)胞產(chǎn)生的多功能內(nèi)源性活性多肽，在心血管系統(tǒng)ANP可增加血管通透性，舒張血管平滑肌，調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡等作用[6]。高于生理劑量的ANP可抑制肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并且對(duì)正常細(xì)胞卻沒(méi)有明顯的毒副作用[4]。這使得ANP可成為一種很有開發(fā)前景的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑。

腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周圍組織及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前研究表明與多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活狀態(tài)有關(guān)[7]。Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路上最關(guān)鍵的信號(hào)分子，因此被用于多種腫瘤的研究中[8]。本實(shí)驗(yàn)CCK8實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002抑制可以抑制MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移。在Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示單用LY294002下調(diào)了人胃癌細(xì)胞株MGC-803中p-Akt的表達(dá)量，而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化。單用ANP同樣下調(diào)了人胃癌細(xì)胞株MGC-803中p-Akt的表達(dá)量，而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化，所以ANP抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖和遷移的機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。

聯(lián)合靶向治療在某些腫瘤的臨床治療中可進(jìn)一步改善臨床療效。在本實(shí)驗(yàn)中ANP聯(lián)合LY294002對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用比二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更為顯著。ANP聯(lián)合LY294002對(duì)MGC-803細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)量降低比二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)也更為顯著，而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化，提示ANP和LY294002聯(lián)合應(yīng)用共同對(duì)抑制PI3K/AKt通路發(fā)揮了增強(qiáng)作用。

綜上所述，ANP可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖和遷移，ANP和LY294002聯(lián)合應(yīng)用共同對(duì)抑制PI3K/AKt通路發(fā)揮了增效作用，為聯(lián)合靶點(diǎn)抑制治療胃癌提供了新的思路。不足的是本實(shí)驗(yàn)從單一細(xì)胞系進(jìn)行研究，并且未作動(dòng)物體內(nèi)的整體實(shí)驗(yàn)，另外ANP對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用以及ANP聯(lián)合LY294002作用增強(qiáng)的原因，可能也與其他信號(hào)通路之間存在著交互作用，有待于進(jìn)一步研究。