邢維佳，趙丹，張國靜，賀雙俊，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院，大慶 163319）

磁場無處不在，所有地球生命都生活在自然低頻電磁場的環(huán)境中，地球磁場對生命的起源、形成和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[1]。在人體、動物以及微生物體內(nèi)含有微量的強磁性物質(zhì)，由于這種物質(zhì)的存在使得生物體對磁場有著敏銳的反應(yīng)[2-3]。當(dāng)前的研究主要集中在磁場對人體和動物細(xì)胞的影響，進(jìn)展緩慢。相對于人體和動物而言，微生物結(jié)構(gòu)簡單，易于培養(yǎng)，而作為地球上古老微生物之一的趨磁細(xì)菌（Magnetotactic bacteria，MTB） 是研究磁場適應(yīng)機(jī)制的理想微生物[4]。MTB 是一類對磁場有趨向性的革蘭氏陰性細(xì)菌，其菌體能吸收外界環(huán)境中鐵、硫元素并在體內(nèi)合成有膜包被的磁性納米顆粒Fe3O4或Fe3S4晶體，即磁小體[5]。MTB 在海洋、湖泊以及陸地環(huán)境中普遍存在，其通常在有氧/無氧界面的水體和沉積物中發(fā)現(xiàn)[6-7]。

磁場對MTB 影響機(jī)制的研究甚少，當(dāng)前研究主要集中在磁場對組織、細(xì)胞的影響上。研究發(fā)現(xiàn)隨著加入磁場的曝磁時間的延長，能在一定程度上減少菌體量，同時也會減弱細(xì)菌的氧化還原能力。結(jié)合細(xì)菌生長動力學(xué)的研究可知，磁場對菌體的作用是直接殺死了部分細(xì)菌，而非抑制細(xì)菌的生長繁殖[8-9]。近些年來，將磁場應(yīng)用至微生物群落也逐漸成為研究發(fā)展的趨勢。在高強度磁感應(yīng)（＞10 mT）作用下，微生物群落豐度及多樣性相較于未加磁場變化最明顯[10-11]。目前，對MTB 的研究主要在淡水和海水的多樣性方面，對于火山露頭泉生境研究甚少。而火山露頭泉中存在大量的鐵、硫元素，是研究MTB 的理想地點。碧泊露頭泉位于五大連池火山區(qū)老黑山南側(cè)熔巖臺地，其湖泊底部分布著眾多大小不同的自涌泉。碧泊面積最大，水中有豐富而難于溶解的礦物質(zhì)，水體溫度常年保持在8 ℃左右，且pH 為7.20 左右[12-14]。特殊的地質(zhì)特征、特殊的水溫條件構(gòu)成了在碧泊這一小尺度的生物區(qū)系，因此它是研究磁環(huán)境脅迫生物的最理想的區(qū)域。擬建立外加磁場研究其強度及作用時間（雙梯度）對碧泊露頭泉沉積物中MTB 多樣性的影響。采用Hiseq 2500 高通量測序技術(shù)，解析在不同磁場強度同一曝磁時間、同一磁場強度不同曝磁時間碧泊沉積物中MTB 的系統(tǒng)發(fā)育多樣性及OTU豐度的變化情況。并通過物種群落結(jié)構(gòu)圖以及Alpha多樣性分別分析磁場強度、作用時間對MTB 多樣應(yīng)及豐度的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

碧泊露頭泉沉積物（五大連池火山區(qū)老黑山南側(cè)熔巖臺地）；磁鐵（50 mT，85×65×18 mm，北京久久高科磁性材料有限公司）；巴斯德吸管（上海亞亦生物有限公司）；引物515F，909R（上海生物工程有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京博邁德生物有限公司）；AxyPrep PCR 產(chǎn)物清潔試劑盒（蘇州康寧生命科學(xué)有限公司）。

TD8620 手持式數(shù)字特斯拉計（上沙天恒測控技術(shù)有限公司）；PCR 儀（2720 型，賽默飛世爾科技有限公司）；Nanodrop（2000，賽默飛世爾科技有限公司）；高通量測序儀（HiSeq 2500，Illumina，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集及預(yù)處理

在碧泊露頭泉中采集表層沉積物樣品，使用抓斗式采泥器采集表層0～5 cm 的沉積物，湖泊設(shè)置3個大采樣點，每個大采樣點由緯度一致的5 個小采樣點組成，每個小采樣點采集1 個樣品，5 個樣品無菌操作等比例混合作為單獨樣，將3 個大采樣點采集的沉積物樣品無菌操作等比例混合獲得混合樣。

樣品預(yù)處理：混合后的樣品裝入經(jīng)滅菌處理的采樣瓶中，原位水體采自沉積物樣品的上方，其中沉積物與原位水的比例為2∶1，做好標(biāo)記，低溫避光運至實驗室。

1.2.2 磁場響應(yīng)試驗

不同磁場強度同一曝磁時間：利用由普通磁鐵對（85×65×18 mm）采用TD 8620 手持式數(shù)字特斯拉計測量建立相吸型靜態(tài)磁場（10、50、100 Gs），以地磁場（0.5 Gs）為對照樣品。隨機(jī)選取4 個預(yù)處理后的樣品分別置于地磁場、10、50、100 Gs 的靜態(tài)磁場中進(jìn)行避光處理。在曝磁的第6 周進(jìn)行磁收集等后續(xù)實驗。

同一磁場強度不同曝磁時間：隨機(jī)選取3 個預(yù)處理后的樣品分別置于由上述普通磁鐵對建立的50 Gs的磁強度中1、6、37 周進(jìn)行避光處理。分別在曝磁的第1 周、第6 周以及長期富集的第37 周取出樣品瓶進(jìn)行磁收集進(jìn)行后續(xù)的實驗。

隨機(jī)取6 個預(yù)處理后的樣品分別置于靜態(tài)磁場（地磁場、10、100 Gs 每個磁場強度有2 組）中，避光處理。在曝磁的第1 周取出1 組（地磁場、10、100 Gs）樣品瓶進(jìn)行磁收集等后續(xù)實驗，同理在第37 周取出另外1 組樣品進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 MTB 的磁收集

在經(jīng)過磁響應(yīng)試驗的樣品瓶上用膠帶將500 Gs磁鐵粘在泥水交界面處，S 極面向瓶壁，采用事先滅菌的巴斯德管使樣品瓶中的表層沉積物均勻化，富集30 min。取若干個尖端融封且滅過菌的巴斯德管，在巴斯德管的前端加入經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后的原位湖水，在巴斯德管后端加入富集30 min 后小磁鐵正后方樣品瓶中的泥水混合物樣品，將巴斯德管前端放入500 Gs 的磁場中收集30 min。收集巴斯德管尖端2 cm 的液體，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增與測序

磁收集后的菌液作為PCR 的模板，采用細(xì)菌16S rRNA V4 區(qū)引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和909R（5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。該PCR 的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix 取25 μL，上下游10 μm 的引物各1 μL，R-T 收集菌液23 μL。PCR 擴(kuò)增的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，45 s、56 ℃，60 s、72 ℃，60 s，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，合格的樣品使用AxyPrep PCR 產(chǎn)物清潔試劑盒進(jìn)行回收，并用Nanodrop 對其濃度和質(zhì)量進(jìn)行測定。檢測合格的樣品直接在北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

MTB 的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析：采用Illumina Hiseq 2500 高通量測序平臺對合格的樣品進(jìn)行序列分析。對原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列（Tags）。將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU 的序列組成得到各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖。通過Alpha 多樣性分析研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計了各樣品在97%相似度水平下的Ace 和Shannon 指數(shù)[15-16]。通過Beta 多樣性分析來比較不同樣品在物種多樣性方面（群落組成及結(jié)構(gòu)）存在的差異大小[17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 磁場對碧泊樣品中MTB Alpha 多樣性的影響

Alpha 多樣性可以反應(yīng)樣品的物種豐度和物種多樣性。通常Chao1 和ACE 指數(shù)衡量物種豐度，Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性。不同磁場強度下曝磁6 周的碧泊露頭泉樣品中MTB 的Alpha 多樣性如圖1a 所示。在磁場強度為50 Gs 時ACE 指數(shù)最小（210.8），而在10 Gs 下最大（230.9）。在50 Gs 磁場下Shannon 指數(shù)為3.12，而在100 Gs磁場下為3.68。ACE 指數(shù)越大表明群落的物種豐度越高，Shannon 指數(shù)越高則說明樣品中物種多樣性越高。隨磁場強度的增加，MTB 群落的豐度呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，而MTB 群落多樣性則呈先降后升的單谷型。在不同曝磁時間作用下MTB 的Alpha 多樣性如圖1b 所示。ACE 指數(shù)在曝磁6 周時最大，而在曝磁37 周時最小。Shannon 指數(shù)的變化趨勢和ACE指數(shù)相同。隨曝磁時間的增加，MTB 的多樣性及豐度均在第6 周上升，呈現(xiàn)出先升后降的單峰趨勢。

圖1 碧泊樣品中MTB 的Alpha 多樣性指數(shù)（a，不同磁場強度；b，不同曝磁時間）Fig.1 Alpha diversity index of MTB in Bibo samples（a，different magnetic field intensity；b，different processing times）

3.2 磁場對碧泊樣品中MTB Beta 多樣性的影響

通過Beta 多樣性分析比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度?；赪eighted Unifrac 算法的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示[17]，不同磁場強度作用下，地磁場（0.5 Gs）和10 Gs 磁場樣品聚在一起，說明兩者之間的MTB 群落結(jié)構(gòu)相似度最高（圖2a）。這表明在一定范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)脑黾哟艌鰧θ郝浣Y(jié)構(gòu)的影響不大，但磁場強度超過一定范圍則會影響MTB 的群落結(jié)構(gòu)。而在不同曝磁時間，各樣品分別占據(jù)不同區(qū)域且相隔較遠(yuǎn)（圖2b），說明不同處理時間的樣品中MTB 的群落結(jié)構(gòu)各不相同。以上分析表明，磁場強度的大小和曝磁時間可能是影響MTB 類群演化的主要因素之一。

為了更加明確磁場強度和曝磁時間的關(guān)系，將地磁場（0.5 Gs）、10、50 Gs 和100 Gs 下分別曝磁處理1、6 和37 周的數(shù)據(jù)匯集在一起，采用上述方法解析各時期樣品間MTB 菌群差異。結(jié)果顯示，所有樣品按時間聚成三大類，且每類中的聚集程度各不相同（圖3）。處理1 周的樣品聚集緊密，6 周樣品相對松散，而第37 周中有兩個樣品聚在一起其余兩個樣品距離較遠(yuǎn)。從時間角度看，處理時間越短樣品聚集程度越緊密，MTB 群落組成相似性越大。以上分析表明，曝磁時間是影響MTB 菌群組成的重要因素，而磁場強度則是影響MTB 主要類群分異的關(guān)鍵因素。

圖2 碧泊樣品中MTB 的主坐標(biāo)分析（a，不同磁場強度；b，不同曝磁時間）Fig.2 Principal coordinate analysis of MTB in Bibo samples（a，different magnetic field intensity；b，different processing times）

圖3 不同磁場和曝磁時間下MTB 的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of MTB under different magnetic field and processing time

3.3 磁場對碧泊樣品中MTB 群落組成的影響

從群落組成上看，不同磁場強度下豐度大于0.1%的MTB 門類包括Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Gracilibacteria 和Parcubacteria （ 圖4a）。Proteobacteria 的豐度隨磁場強度的增加呈現(xiàn)單峰走勢，且其豐度均大于地磁場的樣品。Actinobacteria 在各磁場強度中的相對豐度與Proteobacteria 相反，呈先下降后上升的趨勢，且在50 Gs 下所占豐度最高為5.58%。在屬水平上，0.5 Gs 樣品菌屬豐度差異不顯著，無優(yōu)勢菌屬。隨磁場強度的增大，在10、50 Gs 和100 Gs 磁場下的優(yōu)勢菌屬分別是PRD01a011B（33.35%）、Methylobacter （25.71%）和hgcl_clade（17.41%）。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于菌屬對磁場強度的耐受程度不同。此外，已報道的MTB 屬Magnetospirillum 在0.5 Gs、10 Gs 以及50 Gs樣品中分別占5.74%、1.19%和3.46%（圖4b）。

同一磁場不同曝磁時間下豐度大于0.1%的MTB 門 類 包 括Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Woesearchaeota_[DHVEG6]和Parcubacteria（圖5a）。其中，Proteobacteria 和Woesearchaeota_[DHVEG6]的豐度均隨曝磁時間的增加而上升，均在37 周達(dá)到峰值。Bacteroidetes 的豐度則隨時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的單峰走勢。屬水平上，隨曝磁時間的增加優(yōu)勢菌屬由PRD01a011B （33.35%） 變?yōu)锳cinetobacter （30.90%） 最終 變 為Escherichia -Shigella（43.21%）（圖5b）。Magnetococcus 在曝磁37周所占豐度（23.91%）遠(yuǎn)大于曝磁1 周和6 周。上述研究表明，外加磁場對MTB 的菌群組成及豐度存在較大影響，增加曝磁時間可能有利于MTB 古菌以及趨磁球菌的生長。

圖4 不同磁場強度下MTB 門水平（a）和屬水平（b）群落組成及相對豐度Fig.4 Community composition and relative abundance of MTB at phyla level（a）and genus level（b）under different magnetic field intensity

圖5 不同曝磁時間下MTB 門水平（a）和屬水平（b）群落組成及相對豐度Fig.5 Community composition and relative abundance of MTB at phyla level（a）and genus level（b）at different processing time

3.4 磁場對碧泊樣品中MTB 群落功能的影響

從功能基因豐度來看，本試驗檢測到KEGG 中的6 大類功能（圖6a）。四種磁場強度下豐度最高的功能基因為新陳代謝Metabolism 相關(guān)基因（0.5 Gs：62.51%；10 Gs：62.61%；50 Gs：61.96%；100 Gs：62.57%），其次是環(huán)境信息處理Environmental Information Processing 相關(guān)基因、遺傳信息處理Genetic Information Processing 相關(guān)基因、人類疾病Human Diseases 相關(guān)基因、細(xì)胞過程Cellular Processes 相關(guān)基因、生物體系統(tǒng)Organismal Systems 相關(guān)基因。比較結(jié)果顯示，除10 Gs 磁場下6 類功能的豐度排序與地磁場不同外，其余磁場均相同，即外加10 Gs 磁場改變了6 類KEGG 功能基因的排序。不同曝磁時間下豐度最高的功能基因為新陳代謝Metabolism 相關(guān)基因（1 week：59.88%；6 week：61.96%；37 week：61.67%），其次是遺傳信息處理Genetic Information Processing 相關(guān)基因、環(huán)境信息處理Environmental Information Processing 相關(guān)基因、人類疾病Human Diseases 相關(guān)基因、細(xì)胞過程Cellular Processes 相關(guān)基因、生物體系統(tǒng)Organismal Systems 相關(guān)基因（圖6b）。隨曝磁時間的增長，6 類功能基因相對豐度的排序并未發(fā)生變化。

圖6 KEGG 功能基因相對豐度（a，不同磁場強度；b，不同曝磁時間）Fig.6 Relative abundance of KEGG functional genes（a，different magnetic field intensity；b，different processing times）

4 討論

磁場對微生物的影響較復(fù)雜，通常較強的磁場會抑制微生物的生長，而弱磁場對微生物生長可能有促進(jìn)作用，不同種類微生物其磁效應(yīng)的結(jié)果也不同[9]。研究結(jié)果顯示，增加磁場在一定程度上提高了MTB 的菌群豐度，而持續(xù)增加磁場強度則會降低其豐度（圖1a）。有研究顯示，盡管磁場抑制了Escherichia coli 和Pseudomonas putida 菌體的生長，但增強了細(xì)菌的發(fā)酵活性和水平。在撤去磁場后，菌體的生長速率很快恢復(fù)，并有所增強[18]。通過比較磁場對Escherichia coli，Leclercia adecarboxylata 和Staphylococcus aureus 的影響，發(fā)現(xiàn)隨著暴露時間的延長、處理溫度和磁場強度的升高，細(xì)菌活性均降低，但是降低的程度隨細(xì)菌種類不同而不同[19-21]。隨著曝磁處理時間的增長，MTB 的菌群多樣性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢（圖1b），這與前人的研究結(jié)果相呼應(yīng)[20]。Beta 多樣性結(jié)果顯示，一定程度增加磁場對MTB 的群落組成的影響不大，但繼續(xù)增加磁場將影響MTB的菌群相似性（圖2a）。在強磁感應(yīng)強度（＞10 mT）作用下，微生物群落豐度及多樣性相較于地磁場變化最明顯[10]，同時磁場強度的大小對菌群的存活率也有不同的影響。結(jié)果還顯示，隨曝磁時間的增加，MTB菌群組成顯著變化，而磁場強度是改變同一時期樣品菌群分異的重要因素（圖3）。

不同磁場強度作用下，MTB 的優(yōu)勢菌門均為Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 和 Gracilibacteria。其中，Gracilibacteria 在地磁場下占比高于其他磁場強度，而Actinobacteria 在100 Gs 磁場下占比最高，是地磁場的2.2 倍（圖4）。有研究通過研究外加磁場對SBR 處理系統(tǒng)（序批式活性污泥法）微生物群落的影響，結(jié)果顯示，磁場的加入在一定程度上可以提高SBR 系統(tǒng)的運行性能，且在磁場強度為700 Gs 時SBR 系統(tǒng)運行性能提高效果最明顯。同時，中高強度磁場能提高污泥脫氫酶活性[10]。研究從屬水平來看，地磁場下適宜多種菌屬的生長，而其他磁場強度下存在最優(yōu)菌屬。在不同曝磁時間下，共有的MTB 菌門包括Proteobacteria 和Bacteroidetes。Woesearchaeota_[DHVEG6]在曝磁37 周所占比例是第1周的15 倍，由此可推測，曝磁時間的增長可能促進(jìn)趨磁古菌的生長，也可能是趨磁古菌在強磁場和長期曝磁下有較強的存活能力。從菌群功能角度來看，時間和磁場均對MTB 功能基因產(chǎn)生影響，但磁場的介入引起了更多的功能基因的變化（圖6）。以往關(guān)于MTB 菌群對磁場響應(yīng)的研究甚少，而趨磁螺菌AMB-1 單菌對磁場響應(yīng)研究表明，0.2 T 的強恒磁場能夠抑制AMB-1 菌體生長，但上調(diào)指數(shù)期菌體的mms13 基因的表達(dá)，同時促進(jìn)其磁小體的形成[22-23]。補償式零磁空間（＜500 nT）可以延遲指數(shù)期AMB-1磁小體的形成而對AMB-1 菌體的生長沒有影響[24]。因此，在后續(xù)的研究過程中，要綜合考慮MTB 菌群中與磁小體合成相關(guān)基因?qū)Υ艌龅捻憫?yīng)關(guān)系，全面解讀磁場對沉積物MTB 菌群的影響。

5 結(jié)論

通過研究不同磁場強度同一曝磁時間和同一磁場強度不同曝磁時間對碧泊露頭泉中MTB 多樣性的影響，得出：（1）磁場的加入在一定程度上增加了MTB 菌群豐度，但降低了MTB 的多樣性；（2）長時間的曝磁處理是引起MTB 菌群異化的重要因素，而磁場強度則是控制這種差異大小的驅(qū)動力；（3）磁場強度是影響菌群功能變化的重要因素。