梁雪梅，林欣梅，曹家寶，魏美霞，曹龍奎，李志江，4，鹿保鑫，4

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心；3. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心）

綠豆[1]又名青小豆、植豆，是一種富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、淀粉及多種礦物質(zhì)的功能性雜糧豆類，具有清熱解毒、延緩衰老、消暑養(yǎng)顏的食用價(jià)值。除此之外，綠豆還有降血糖[2]、降血脂[3]、降壓抗癌[4]、保護(hù)肝臟[5]及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[6]的功能特性，這些可能與綠豆本身具有的生物活性化合物有關(guān)，尤其是綠豆中的酚類、黃酮類物質(zhì)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，豆類在發(fā)芽后，化學(xué)組成、營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味會(huì)發(fā)生明顯變化[7-8]。李曉紅等[9]現(xiàn)芽苗在生長過程中維生素、γ-氨基丁酸（GABA）、酚類和黃酮類物質(zhì)含量均有顯著的增加，且表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

多酚類化合物是一種具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、清除體內(nèi)自由基等功效的活性物質(zhì)[10]。由于能夠限制氧自由基及一些還原性氧化合物，因此可以預(yù)防和治療一些與免疫力低下的相關(guān)疾病，比如多酚對預(yù)防乳腺疾病、癌癥、糖尿病、防止骨質(zhì)疏松具有很好的作用[10-11]。目前，多酚化合物在石榴皮[12]、玉米須[13]、豆類[14]、蠶豆[15]等物質(zhì)中已有廣泛研究。也有研究證實(shí)豆類中的黃酮類和酚類中特有的植物雌激素對延緩更年期、保護(hù)卵巢，預(yù)防乳腺疾病有顯著的效果[16-17]。

目前常見的多酚提取方法有溶劑法[18]、超聲波輔助法[19]、微波輔助法[20]、酶法[21]和超聲微波輔助法[22]。超聲微波輔助法[23-24]將超聲波良好的空化作用與微波的熱效應(yīng)相結(jié)合，可以有效破壞原料的細(xì)胞壁，加速溶劑擴(kuò)散及溶質(zhì)的流出，克服了常規(guī)方法中的萃取不足，相對于其他提取方法操作簡便的同時(shí)還能夠更好地保護(hù)提取物的結(jié)構(gòu)。蔣志國[25]和閻海青[26]等利用超聲-微波輔助法分別提取菠蘿蜜果皮及藍(lán)莓中的多酚化合物，提取多酚化合物含量高、抗氧化活性良好。目前有關(guān)多酚的研究多數(shù)是針對綠豆中的，而對綠豆芽多酚的研究還相對較少，尤其是在提取工藝上的研究，更是未見報(bào)道[27]。綠豆在發(fā)芽后酚類物質(zhì)會(huì)顯著增加，所以如何有效地提取綠豆芽中的多酚類物質(zhì)并在提取過程中保持其生物活性就變得尤為重要。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠豆芽在芽長4~5 cm 時(shí)多酚含量最高且具有良好的抗氧化活性，因此研究以4~5 cm 芽長的綠豆芽作為優(yōu)化提取工藝的試驗(yàn)原料，利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)提取綠豆芽中的多酚物質(zhì)，以單因素為基礎(chǔ)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析處理，在優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察優(yōu)化提取工藝后綠豆芽多酚的體外抗氧化活性，為以后綠豆芽中多酚物質(zhì)的保留和綠豆芽營養(yǎng)產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

綠豆，山西大同小明；甲醇、乙醇、無水碳酸鈉，均為分析純，購自遼寧泉瑞試劑有限公司；福林酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品，均為分析純，購自Sigma 公司。

CB-AS-323B 型康麗豆芽機(jī)，佛山市順得區(qū)嘉壕實(shí)業(yè)有限公司；AR323CN 電子天平，青島明博環(huán)?？萍加邢薰荆籇GG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SE-750 型高速粉碎機(jī)，永康市艾澤拉電器有限公司；RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；CW-2000 超聲-微波協(xié)同萃取儀，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；TDZ5-WS 低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

利用發(fā)芽機(jī)將綠豆進(jìn)行發(fā)芽處理后篩選出芽長4~5 cm 的綠豆芽，去離子水洗凈后于45 ℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎過篩，得到80 目綠豆芽粉真空包裝于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 綠豆芽多酚的提取

根據(jù)Zhang 等[28]方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取2.0 g綠豆芽粉于燒杯中，以1∶30 的料液比加入60 mL 70%的乙醇溶液，混勻后置于超聲微波萃取儀中，設(shè)置超聲時(shí)間、超聲溫度和微波功率，萃取結(jié)束后取出置于離心機(jī)中，在轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1下離心10 min，收集上清溶液。向沉淀物中再次加入60 mL 60%乙醇水溶液，重復(fù)上述步驟，合并兩次離心后得到的上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45 ℃條件下旋至無水狀態(tài)，殘余物用70%甲醇洗出定容至至10 mL，得待測多酚提取液，分裝后凍存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 多酚含量的測定

根據(jù)Folin-Ciocalteu[29]法稍作修改，得線性方程為y=0.117 7 x+0.004 8，R2=0.999 8，線性關(guān)系良好。多酚含量測定結(jié)果以干基1 g 綠豆芽粉樣品中所含沒食子酸當(dāng)量（mg gallic acid equivalents/g dry weight）表示，簡寫為mg GAE/g DW。多酚含量公式如下：

式中：X 為樣品中多酚含量（mg GAE/g DW）；ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出的待測液中多酚的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）V 為待測液體積/mL；N 為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對多酚含量的影響

選擇超聲溫度為30 ℃，微波功率為400 W，超聲時(shí)間為1 200 s，考察料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 時(shí)對多酚含量的影響。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對多酚含量的影響

選擇超聲溫度為30 ℃，微波功率為400 W，料液比為1∶25，考察超聲時(shí)間為800，1 000，1 200，1 400，1 600 s 時(shí)對多酚含量的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對多酚含量的影響

選擇超聲時(shí)間為1 200 s，微波功率為400 W，料液比為1∶25，考察超聲溫度為25，30，35，40，45 ℃時(shí)對多酚含量的影響。

1.2.4.4 微波功率對多酚含量的影響

選擇超聲溫度為30 ℃，超聲時(shí)間為1 200 s，料液比為1∶25，考察微波功率為300、400、500、600、700 W 時(shí)對多酚含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用Design- Expert8.0.6軟件進(jìn)行Box-Benhnken 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，自變量的四個(gè)因素分別為料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、微波功率，響應(yīng)值為多酚含量，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，如表1 所示。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Level design of response surface factors

1.2.6 體外抗氧化能力的測定

1.2.6.1 DPPH 清除能力的測定

用無水乙醇配制0.2 mmol·L-1的DPPH 溶液，0～4 ℃冰箱中避光保存。將綠豆芽多酚提取液稀釋成分別稀釋成濃度梯度為2%、4%、6%、8%、10%，取2 mL于試管中，加入2 mL DPPH 溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，517 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次。用Vc 作陽性對照，DPPH 清除率計(jì)算公式如下：

其中：A0為空白對照液的吸光度值；A1為樣品測定的吸光度值；A2為無水乙醇對照組的吸光度值。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除能力的測定

配制ABTS 自由基儲(chǔ)備液：稱取0.1 g ABTS 和0.029 g 過硫酸鉀粉末，用蒸餾水定容至100 mL，置于4 ℃冰箱中備用，使用前稀釋至734 nm 處吸光度為0.700±0.020。將綠豆芽多酚提取液稀釋成濃度梯度為10%、20%、30%、40%、50%，取0.2 mL 于試管中，加入5.8 mL ABTS 溶液，混勻后避光反應(yīng)6 min，734 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次。用Vc 作陽性對照，ABTS 自由基清除率計(jì)算公式如下：

其中：Ai為空白對照液的吸光度值；Aj為樣品測定的吸光度值；Aw為對照組的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2011、Design Expert 8.0.6、SPSS 13.0軟件進(jìn)行繪圖、數(shù)據(jù)處理和顯著性分析，P＜0.05 表示顯著，P＜0.01 表示極顯著。每次試驗(yàn)均重復(fù)三次。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對綠豆芽多酚含量的影響

不同料液比對綠豆芽多酚含量的影響如圖1 所示。

圖1 料液比對多酚含量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol content

由圖1 可以看出，隨著料液比的增加，多酚含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，料液比在1∶15 至1∶25 時(shí)增長趨勢較明顯，而在1∶25 至1∶35 時(shí)增長緩慢，含量變化不再顯著，在料液比為1∶35 時(shí)多酚含量達(dá)到最高，為23.195 mg GAE/g DW，與1∶25 時(shí)的多酚含量相差甚微。因此，選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30 作為料液比這一因素的3 個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 超聲時(shí)間對綠豆芽多酚含量的影響

不同料超聲時(shí)間對綠豆芽多酚含量的影響如圖2 所示。

圖2 超聲時(shí)間對多酚含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polyphenol extraction

由圖2 可以看出，多酚含量隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在1 000 s 時(shí)多酚含量達(dá)到最高，為23.158 mg GAE/g DW。且在1 200 s以后，多酚提取含量已經(jīng)明顯低于提取時(shí)間800 s 時(shí)的提取含量。經(jīng)分析可以推測，這個(gè)結(jié)果可能是由于綠豆芽粉中的多酚與蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)有較強(qiáng)結(jié)合作用，所以當(dāng)超聲時(shí)間在一定范圍以內(nèi)時(shí)，多酚溶出率逐漸升高；而當(dāng)其溶出率達(dá)到頂點(diǎn)后再繼續(xù)萃取，由于較強(qiáng)的超聲-微波作用力，多酚類物質(zhì)降解的可能性增大，從而影響了多酚的提取效率，導(dǎo)致多酚提取含量降低[30]。因此，選擇時(shí)間為800、1 000、1 200 s 做超聲時(shí)間這一因素的3 個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.3 超聲溫度對綠豆芽多酚含量的影響

不同超聲溫度綠豆芽多酚含量的影響如圖3 所示。

由圖3 可以看出，當(dāng)多酚的超聲溫度升高時(shí)，多酚提含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在35～45 ℃區(qū)間，多酚含量幾乎無太大變化，在30 ℃時(shí)多酚含量達(dá)到最高，為22.871 mg GAE/g DW。因此選擇溫度為25、30、35 ℃作為超聲溫度這一因素的3 個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖3 超聲溫度對多酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol extraction

2.1.4 微波功率對綠豆芽多酚含量的影響

不同料微波功率對綠豆芽多酚含量的影響如圖4 所示。

圖4 微波功率對多酚含量的影響Fig.4 Effect of microwave power on polyphenol extraction

由圖4 可以看出，當(dāng)微波功率升高時(shí)，多酚含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在微波功率為400 W時(shí)，多酚含量達(dá)到最高，為23.352 mg GAE/g DW。當(dāng)微波功率達(dá)到500 W 時(shí)，多酚含量急劇下降，這可能是由于功率過高反而破壞了多酚的分子結(jié)構(gòu)，從而致使多酚溶出量減少，多酚提取率下降[18]。因此選擇功率為300、400、500 W 作為微波功率這一因素的3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表1 的因素水平分析及單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4 因素3 水平Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，設(shè) 計(jì)綠豆芽多酚優(yōu)化提取方案與結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and results

該響應(yīng)面共設(shè)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，2、3、12、16、15 五個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，重復(fù)5 次試驗(yàn)評估試驗(yàn)誤差，由表2 可知中心試驗(yàn)點(diǎn)的平均值為23.42±0.59 mg GAE/g DW，誤差極小，符合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

Y =23.42 +0.60·A +0.66·B +0.028·C +1.62·D +0.35·AB+0.23·AC-0.098·AD+0.013·0.075BD+0.32·CD-2.40·A2-2.26·C2-2.96·D2

式中：Y 為多酚含量；A、B、C、D 分別代表超聲時(shí)間、微波功率、超聲溫度、料液比的水平數(shù)。

2.2.2 模型顯著性檢驗(yàn)

對綠豆芽多酚優(yōu)化提取試驗(yàn)的線性回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知，模型參數(shù)中，A、B 的P＜0.01，表明超聲時(shí)間對多酚的影響特別顯著，A2、B2、C2、D2的P＜0.000 1，表明超聲時(shí)間的二次項(xiàng)、微波功率的二次項(xiàng)、超聲溫度的二次項(xiàng)及料液比的二次項(xiàng)對多酚的影響均極其顯著；總模型方程也極其顯著（P＜0.000 1）；R2=95.69，表明模型相關(guān)度較好，僅有4.31 的變異模型；變異系數(shù)C·V=3.40，即試驗(yàn)重復(fù)性較好且模型可信度較高；失擬項(xiàng)的P 值為0.399 5（P＞0.05），這也表明了模型與試驗(yàn)結(jié)果的擬合度較高，即該模型的預(yù)測值與實(shí)際值誤差較小。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

為了能夠更加直觀清晰地反映出四個(gè)因素對響應(yīng)值的影響，利用Design Expert 8.0.6 軟件繪制三維模型圖，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同提取因素對多酚提取率的交互作用Fig.5 Interaction of different extraction factors on extraction rate of polyphenols

由于可根據(jù)等高線的形狀推測出兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，若兩個(gè)因素的等高線呈橢圓狀則說明兩者交互顯著，如若兩個(gè)因素的等高線呈現(xiàn)圓狀則交互不顯著[31]。由圖5 可知，微波功率與超聲溫度交互作用較弱（圖5b），超聲時(shí)間與超聲溫度交互作用較弱（圖5c），微波功率與超聲時(shí)間交互作用也呈現(xiàn)交互較弱的形態(tài)（圖5f），而料液比與時(shí)間、功率、溫度的交互作用均相對顯著（圖5a，圖5d，圖5e），這與表3 得到的結(jié)果相一致；并且由圖5 可以清晰地看出，在各個(gè)因素下的多酚提取率均呈現(xiàn)出先上升后下降的形態(tài)，因此可以分析得出該響應(yīng)面的極值點(diǎn)即為其響應(yīng)面的最高點(diǎn)[32]，此時(shí)多酚的提取率最佳，對二次回歸線性擬合方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零。得到的料液比為1∶26.38，超聲時(shí)間為1 028 s，超聲溫度為35.16 ℃，微波功率為422 W，多酚提取含量預(yù)測值為23.76 mg GAE/g DW。為試驗(yàn)操作方便，可將工藝參數(shù)優(yōu)化更正為料液比1∶26，超聲時(shí)間為1 028 s，超聲溫度為35 ℃，微波功率為422 W，這與藍(lán)蔚青[33]、錢敏[34]等分析的結(jié)果相似。

將響應(yīng)面優(yōu)化后得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，按同樣的提取方法利用優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取發(fā)芽4~5 cm 綠豆芽中的多酚，得到的多酚含量為24.12 mg GAE/g DW，該值與預(yù)測值23.76 mg GAE/g DW相接近。因此該響應(yīng)面回歸模型具有可靠性。

2.3 抗氧化能力測定的結(jié)果

2.3.1 綠豆芽多酚的DPPH 清除能力

由圖6 可以看出，隨著綠豆芽多酚提取液與Vc濃度的增加，對DPPH 的清除能力也呈現(xiàn)上升的趨勢，在濃度區(qū)間為0~2%時(shí)，清除能力上升顯著；而當(dāng)發(fā)芽綠豆多酚濃度達(dá)到10%時(shí)，DPPH 清除率幾乎接近Vc 水平，此時(shí)清除率可達(dá)94.57%。

圖6 綠豆芽多酚的DPPH 清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of mung bean sprouts polyphenols

2.3.2 綠豆芽多酚對ABTS·+的清除能力

圖7 綠豆芽多酚的ABTS·+清除能力Fig.7 ABTS·+ scavenging ability of mung bean sprouts

由圖7 可以看出，在濃度0~0.1 之間，綠豆芽多酚提取液對ABTS·+的清除能力與Vc 對ABTS·+的清除能力相當(dāng)；在樣本濃度達(dá)到50%時(shí)，綠豆芽多酚的ABTS·+清除能力又一次接近Vc 清除水平，此時(shí)清除率為94.54%。

3 結(jié)論

采用超聲微波輔助提取綠豆芽多酚，利用響應(yīng)面法分析研究各工藝參數(shù)對綠豆芽多酚含量的影響及各因素之前存在的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在料液比1∶26、超聲時(shí)間1 028 s、超聲溫度35 ℃、微波功率422 W時(shí)，優(yōu)化后預(yù)測綠豆芽多酚提取含量為23.76 mg GAE/g DW，實(shí)測值為24.12 mg GAE/g DW，該響應(yīng)面回歸模型具有可靠性。對綠豆芽多酚提取液的抗氧化能力進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明，在綠豆芽多酚提取液濃度為10%時(shí)，對DPPH 的清除率達(dá)到94.57%，接近該濃度下Vc 的清除能力；在綠豆芽多酚提取液濃度為50%時(shí)，對ABTS·+清除率達(dá)到94.54%，接近該濃度下Vc 的清除能力。結(jié)果可為以后綠豆芽多酚活性物質(zhì)的應(yīng)用提供理論參考。