楊闖，潘順圓，劉鑫悅，李震東，楊帆，裴娜，孫磊，任永寧，孔凡志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

在哺乳動物中，睡眠是一種既普通又異常重要的生理過程。哺乳動物的睡眠呈現(xiàn)周期性、可逆性和自發(fā)性等特點。已有研究證實，良好的睡眠對于動物體的多種機能具有恢復(fù)作用，包括記憶鞏固、增強免疫力和記憶力鞏固等。大量的動物實驗和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，睡眠缺乏可引起過度嗜睡、內(nèi)分泌紊亂、認知功能下降和增加患心腦血管疾病的風(fēng)險等[1]。因此，保證充足的睡眠對與動物機體發(fā)揮正常生理功能至關(guān)重要。但是，隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏的不斷加快，成人和兒童的夜間活動時間顯著增加，睡眠時間明顯減少，不同程度的出現(xiàn)了睡眠剝奪的現(xiàn)象。睡眠剝奪是指由于環(huán)境或自身原因無法滿足正常睡眠，表現(xiàn)為睡眠減少或睡眠的連續(xù)性中斷，長期睡眠剝奪很容易導(dǎo)致行為水平下降、注意力不集中、記憶力喪失和學(xué)習(xí)能力下降等反應(yīng)[2]。睡眠剝奪作為普遍而強烈的應(yīng)激源，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致細胞凋亡，進而改變血腦屏障的通透性誘發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)損傷[3-4]。2019年度中國青少年兒童睡眠健康白皮書數(shù)據(jù)顯示，中國青少年兒童睡眠低于標(biāo)準(zhǔn)時間，睡眠不足已成為常態(tài)：越睡越晚，越起越早，睡眠時間越來越少；睡眠困擾較多，入睡困難、張口呼吸等問題相對突出；中學(xué)生群體發(fā)生較多。有研究表明，睡眠剝奪可對身體健康造成不同程度的影響，但睡眠剝奪對記憶力影響的機理研究仍然有限[5-6]。

藍莓為越桔屬植物，果實呈藍色，其中含有多種生物活性物質(zhì)，具有很好的保健功能并且擁有極高的藥用價值[7]。藍莓中富含的原花青素和花青素在機體抗氧化、減少炎癥、降低DNA 損傷和抗細胞凋亡等諸多方面發(fā)揮重要作用[8-10]。有研究表明，予以小鼠藍莓提取物處理8 個月后，與對照組比較，實驗組小鼠在Y 迷宮測試中消耗時間顯著減少且學(xué)習(xí)記憶成績有明顯的提升[11]。給19 月齡的老齡大鼠飼喂藍莓8 周后，其記憶錯誤次數(shù)減少且認知功能提高[12]。應(yīng)用藍莓提取物和復(fù)合營養(yǎng)素飼喂衰老大鼠，其學(xué)習(xí)記憶能力以及機體抗氧化功能得到明顯的改善[13-14]。然而，藍莓提取物能否改善青年小鼠由于睡眠剝奪導(dǎo)致的記憶力減退尚不明確。因此，項目應(yīng)用發(fā)明的小鼠睡眠剝奪裝置，對4 周齡小鼠進行睡眠剝奪，同時使用藍莓提取物灌胃，然后采用TM-vision 泰盟水迷路行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)分析其記憶力變化情況。觀察、比較藍莓提取物灌胃對于小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響，為后續(xù)開發(fā)改善記憶力減退的藥物奠定理論與試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4 周齡SPF 級雌性昆明小鼠購買自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，小鼠首先在動物房使用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水自由飲食一周，分組并分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔通風(fēng)良好。實驗涉及的實驗動物操作符合黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)（20180328002）。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

TM-vision 泰盟水迷路行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)（中國成都）；小鼠用睡眠剝奪裝置；藍莓提取物通過溶劑萃取法獲得，純度為50%，購自西安瑞林生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)用PBS 購買自Hyclone 公司（美國）。

1.3 動物分組與藍莓提取物灌胃

將15 只4 周齡SPF 級雌性昆明小鼠根據(jù)體重情況隨機分為3 組，對照組、睡眠剝奪組和藍莓提取物灌胃組，每組5 只。藍莓提取物灌胃組小鼠予以5 mg·kg-1體重的藍莓提取物水溶液進行灌胃，每天灌胃一次。對照組和睡眠剝奪組予以等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃21 d。

1.4 小鼠睡眠剝奪模型的建立

采用我們發(fā)明的小鼠睡眠剝奪裝置，應(yīng)用改良多平臺睡眠剝奪法，在藍莓提取物灌胃的第15 天開始對睡眠剝奪組和藍莓提取物灌胃組小鼠進行18 h剝奪，6 h 恢復(fù)休息的睡眠剝奪處理。各組小鼠自造模的第1 天下午6 點開始進入睡眠剝奪箱內(nèi)進行睡眠剝奪試驗，次日中午12 點恢復(fù)睡眠，睡眠剝奪造模共計7 d。睡眠剝奪試驗期間光照節(jié)律為12 h 光照（5：00～17：00）和12 h 黑暗（17：01～4：59）。睡眠剝奪裝置為大鼠籠改造的簡易睡眠剝奪箱，大鼠籠底部各固定5 個直徑約為2.3 cm，高度為5 cm 的圓臺形平臺，平臺材料為PP 塑料，箱內(nèi)注入清水至距平臺頂端約0.5 cm 處左右，保持箱內(nèi)水溫為25±2 ℃，箱上覆蓋有鐵網(wǎng)，每天定時清洗箱內(nèi)排泄物并更換箱內(nèi)的水。

1.5 泰盟TM-vision 水迷路試驗

試驗開始前，先將小鼠放置于水迷路裝置的起點平臺處，讓其適應(yīng)水迷路平臺環(huán)境，時間大約為5 min。然后，將小鼠面壁放置于遠離起點平臺的固定水域，放手后，小鼠自行尋找至起點平臺并登上平臺后試驗結(jié)束，記錄小鼠所需時間。藍莓灌胃期間所有小鼠每天進行5 次水迷路訓(xùn)練，讓其形成記憶。從訓(xùn)練的第15 天開始，對睡眠剝奪組小鼠和藍莓提取物灌胃組小鼠進行睡眠剝奪，睡眠剝奪周期為每天18：00到次日12：00 共計18 h，連續(xù)進行睡眠剝奪7 d。在訓(xùn)練的第22 天和第23 天，也就是睡眠剝奪7 d 后，使用泰盟TM-vision 水迷路行為學(xué)檢測裝置檢測小鼠搜索平臺所需時間是否發(fā)生變化。每只小鼠記錄6 次登上平臺所用時間，取平均值作為最終數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理軟件為SPSS17.0，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，實驗結(jié)果以冀±SD 表示，組間比較采用t檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠剝奪對小鼠記憶力的影響

在使用泰盟TM-vision 水迷路裝置進行記憶力訓(xùn)練過程中，隨著訓(xùn)練的天數(shù)不斷增加，各組小鼠由投放水域自行尋找到起點平臺所用的時間逐漸縮短（表1），表明，小鼠經(jīng)過訓(xùn)練已經(jīng)對平臺的位置產(chǎn)生記憶。然而，自睡眠剝奪開始的第2 天起，與對照組相比，睡眠剝奪組小鼠從投放水域自行尋找起點平臺的時間有明顯的增加（P≤0.05）（表2）。表明，小鼠經(jīng)睡眠剝奪處理后，其記憶力顯著減退。

表1 水迷路訓(xùn)練對小鼠記憶力的影響Table 1 Effects of water maze training on the faculty of mice memory

表2 睡眠剝奪對小鼠記憶力的影響Table 2 Effects of sleep deprivation on the faculty of mice memory

2.2 藍莓提取物灌胃對小鼠體重的影響

為了確定藍莓提取物是否影響小鼠胃腸道的消化與吸收功能，給予小鼠藍莓提取物灌胃處理，共灌胃21 d。每天一次，灌胃濃度為5 mg·kg-1體重。每天記錄小鼠的精神狀態(tài)和糞便狀態(tài)，并定時稱量小鼠體重。結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，藍莓提取物灌胃后小鼠精神狀態(tài)沒有改變、無腹瀉發(fā)生且體重沒有明顯變化（P＞0.05）（表3）。表明，藍莓提取物灌胃的量與方式對小鼠精神狀態(tài)、胃腸道消化與吸收及體重沒有影響。

表3 藍莓提取物對小鼠體重的影響Table 3 Effects of blueberry extracts on the body weight of mice

2.3 藍莓提取物對小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響

為了確定藍莓提取物灌胃對青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響，給予對照組和睡眠剝奪組小鼠蒸餾水灌胃，藍莓提取物灌胃組小鼠以劑量為5 mg·kg-1體重的藍莓提取物進行灌胃，同時使用泰盟TM-vision 水迷路裝置對小鼠進行平臺搜索訓(xùn)練（5 次·d-1），共計21 d。從平臺搜訓(xùn)練的第15 天開始，對睡眠剝奪組和藍莓提取物灌胃組小鼠進行18 h（18：00 到次日12：00）的睡眠剝奪，共進行7 d。睡眠剝奪后，也就是第22 天和第23 天，用泰盟TM-vision 水迷路裝置檢測小鼠的平臺搜索時間變化情況。結(jié)果顯示，與對照組和睡眠剝奪組小鼠相比，藍莓提取物灌胃組小鼠的平臺搜索時間沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）（表4）。表明，藍莓提取物對改善青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退沒有明顯效果。

表4 藍莓提取物對睡眠剝奪導(dǎo)致的小睡記憶力減退的影響Table 4 Effects of blueberry extracts on sleep deprivation induced hypomnesia of mice

3 討論

睡眠是人類和多種哺乳動物生活中重要的組成部分，高質(zhì)量的睡眠是保證身體健康的必要條件。由于疾病或職業(yè)需求導(dǎo)致的失眠嚴(yán)重影響工作效率及身心健康，而且疲勞也是引發(fā)意外事故的主要原因。由于睡眠障礙引發(fā)的認知功能和記憶力下降被WHO 認定為重大公共安全衛(wèi)生問題。睡眠剝奪一般是由環(huán)境或個體自身因素引起，導(dǎo)致個體難以進入睡眠狀態(tài)的一種情況，隨著人們生活節(jié)奏的不斷加快，工作、學(xué)習(xí)壓力越來越大，人們普遍受到由睡眠不足導(dǎo)致的睡眠剝奪狀態(tài)的威脅[15-17]。這種情況在青少年群體發(fā)生率更高長時間處于睡眠剝奪狀態(tài)的青少年，會產(chǎn)生一系列不良表現(xiàn)，如學(xué)習(xí)效率降低、學(xué)習(xí)效果變差、精神面貌渙散、免疫力低經(jīng)常感冒、炎癥頻發(fā)等身體問題。有研究表明，人和動物的學(xué)習(xí)記憶能力受損程度與睡眠剝奪的持續(xù)時間成正比[18-19]。然而，市場上尚無顯著改善睡眠剝奪導(dǎo)致記憶力減退的產(chǎn)品。

人類和動物的睡眠剝奪試驗被廣泛用于研究睡眠功能等相關(guān)問題，睡眠剝奪對大腦活動的宏觀影響包括皮層對外界刺激的響應(yīng)降低，主要表現(xiàn)為注意力不集中。睡眠剝奪對大腦的微觀影響主要是腺苷水平的降低。然而，在不同觀察尺度下，睡眠剝奪影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的機理尚不明確。但是，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過7 d，每天18 h 的睡眠剝奪后，其在進行泰盟TM-vision 水迷路試驗過程中，搜索平臺的時間顯著高于對照組小鼠。表明睡眠剝奪能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)記憶力減退的現(xiàn)象。將在后續(xù)研究中檢測睡眠剝奪組小鼠海馬區(qū)中BDNF、p-ERK 及PDEs 指標(biāo)變化情況及海馬區(qū)的形態(tài)變化，為明確睡眠剝奪導(dǎo)致的小鼠記憶力減退的分子機制奠定基礎(chǔ)。

藍莓果實中富含花青素、單寧、黃酮、多酚、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）確定為人類五大健康食品之一[20]。已有研究證明，藍莓提取物具有良好的清除氧自由基、抗氧化、預(yù)防癌癥、延緩衰老、緩解視疲勞和提高免疫力等功能。藍莓提取物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有廣泛的生物作用，對心腦血管疾病、炎癥以及阿爾茲海默病等都有一定的積極作用。在研究中，以劑量為5 mg·kg-1體重的藍莓提取物對小鼠進行灌胃，連續(xù)灌胃21 d。未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、嘔吐或體重下降的情況，表明藍莓提取物灌胃的量與給藥方式對于小鼠不會造成傷害，以上劑量和給藥方式是安全的。Miller[21]在Morris 水迷宮實驗中發(fā)現(xiàn)，給19 月齡F344 老齡大鼠飼料中添加藍莓、菠菜和草莓的提取物，可逆轉(zhuǎn)其認知功能缺陷。Krikorian等[22]的研究表明，飲食中補充藍莓可提高老年人的記憶力。Whyte 等[23-24]采用隨機雙盲試驗證明低劑量的藍莓提取物（ThinkBlueTM） 可提高老年人記憶力。McNamara 等[25]的研究表明魚油與藍莓聯(lián)用對于改善老人主觀認知障礙具有改善作用。然而，在研究中，采用的藍莓提取物并未對小鼠睡眠剝奪型記憶力減退產(chǎn)生顯著等改善作用。分析有如下原因：（1）泰盟TM-vision 水迷路試驗中的水溫過低，可能導(dǎo)致小鼠處于冷應(yīng)激狀態(tài)，使得小鼠搜索平臺過程中產(chǎn)生了額外刺激因素，影響其平臺搜索時間；（2）研究中選擇的藍莓提取物中有效成分少，灌胃量不足；（3）藍莓提取物攝入周期較短。因此，將在接下來的研究中選擇多種藍莓提取物，且延長灌胃時間，比較不同藍莓提取物對青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的改善作用。通過檢測小鼠海馬區(qū)SOD、GSH-Px 和p-ERK水平探索藍莓提取物改善青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的分子機理。