俞孟軍 譚金晶 王敬慧

肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)最新的Cancer Statistics 2021數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計(jì)2021年美國(guó)新發(fā)肺癌占癌癥新發(fā)病例的12.4%，并會(huì)導(dǎo)致21.7%的癌癥死亡，是致死率最高的惡性腫瘤[1]。根據(jù)國(guó)家癌癥中心2019年發(fā)布的數(shù)據(jù)，肺癌是2015年我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥[2]。目前肺癌的主要治療方式為手術(shù)、化療、放療、靶向和免疫治療等。靶向治療的出現(xiàn)對(duì)于有特定驅(qū)動(dòng)基因突變的患者產(chǎn)生了良好的治療效果，但不可避免地發(fā)生耐藥和疾病進(jìn)展等問(wèn)題[3,4]。同時(shí)，缺乏預(yù)測(cè)療效的生物標(biāo)志物和緩解率較低限制了免疫治療的臨床發(fā)展。腫瘤異質(zhì)性是腫瘤治療面臨困難的重要原因。目前認(rèn)為單細(xì)胞層面的研究能夠獲得更多的關(guān)于腫瘤異質(zhì)性的有價(jià)值信息。湯富酬實(shí)驗(yàn)室在2009年應(yīng)用單細(xì)胞RNA測(cè)序（single‐cell RNA sequencing,scRNA‐seq）分析單個(gè)小鼠的轉(zhuǎn)錄組[5]，使單細(xì)胞層面的分析成為可能。肺癌常常表現(xiàn)出瘤內(nèi)基因組的顯著差異性，其克隆的多樣性影響了臨床的診斷和治療[6]。單細(xì)胞測(cè)序（single‐cell sequencing, SCS）技術(shù)的應(yīng)用為了解肺癌免疫微環(huán)境、發(fā)生和發(fā)展以及免疫治療機(jī)制提供了可能[7]。本文將介紹單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的相關(guān)進(jìn)展，并對(duì)其在肺癌腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、侵襲和轉(zhuǎn)移及治療反應(yīng)和耐藥性等方面進(jìn)行綜述。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

單細(xì)胞測(cè)序的目的是通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）來(lái)識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的基因組序列信息，并獲得細(xì)胞間遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)差異的信息，從而更好地了解單個(gè)細(xì)胞在微環(huán)境中的作用[8]。單細(xì)胞測(cè)序還可以研究單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異、單個(gè)細(xì)胞DNA水平的基因組結(jié)構(gòu)變化、RNA水平的基因表達(dá)變化、基因融合、選擇性剪接、DNA甲基化和組蛋白修飾等[9]。

1.1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展 單細(xì)胞測(cè)序的步驟主要包括：?jiǎn)渭?xì)胞分離、核酸擴(kuò)增、構(gòu)建文庫(kù)、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。其關(guān)鍵是提取獲得完整的有活力的靶細(xì)胞。用于單細(xì)胞分離的技術(shù)方法很多，包括梯度稀釋法[10]、機(jī)械顯微操作技術(shù)[11]、激光捕獲顯微切割技術(shù)[12]、熒光激活細(xì)胞分選[13]、免疫磁分離[14]、微流控平臺(tái)[15]等。

目前常用的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)有SMART‐seq2[16]、Fluidigm C1[17]、10X Genomics[18]、BD Rhapsody[18]等。10X是到目前為止商業(yè)化最成功的平臺(tái)，在主流高影響因子的期刊上有可信的數(shù)據(jù)發(fā)表，并且都與Smart‐Seq數(shù)據(jù)的結(jié)果存在比較。其優(yōu)點(diǎn)包括高通量、低成本、操作簡(jiǎn)便、流程自動(dòng)化程度高、支持文獻(xiàn)數(shù)量多等。但對(duì)細(xì)胞總量及活性要求高，缺乏質(zhì)控點(diǎn)及平臺(tái)環(huán)境較為封閉等不足也限制了其進(jìn)一步的推廣?？偟膩?lái)說(shuō)，研究者應(yīng)根據(jù)自己的需求選擇適合自己的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)。

1.2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用方向 單細(xì)胞測(cè)序主要應(yīng)用于單細(xì)胞基因組測(cè)序（DNA測(cè)序）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA測(cè)序）、表觀遺傳測(cè)序及空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等，它們可以揭示細(xì)胞在不同階段的功能和不同方面的特征。

單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)將分離的單個(gè)細(xì)胞的DNA進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序，用于揭示細(xì)胞群體間差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。到目前為止，這種測(cè)序技術(shù)主要用于發(fā)現(xiàn)DNA分子中的異常[19]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)主要應(yīng)用于胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)和腫瘤多個(gè)領(lǐng)域，鑒定多種組織中不同類(lèi)型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征。除了基因組本身，表觀遺傳修飾（特別是DNA甲基化）和不同的染色質(zhì)成分在基因表達(dá)調(diào)控中也起著重要作用[20]。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使在單細(xì)胞水平上測(cè)量DNA甲基化成為可能。通過(guò)這些單細(xì)胞表觀基因組研究，可以在單細(xì)胞分辨率下分析有關(guān)染色質(zhì)修飾及其潛在調(diào)控效應(yīng)的信息，能夠補(bǔ)充單細(xì)胞DNA測(cè)序和RNA測(cè)序獲得的DNA變異和RNA表達(dá)之外的數(shù)據(jù)[21]。

單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組[22]分析將基因的表達(dá)與組織切片的免疫組化圖像進(jìn)行整合，從而將組織內(nèi)不同細(xì)胞的基因表達(dá)信息定位到組織的原始空間位置上去，區(qū)分哪些基因在組織內(nèi)是活躍的，可以直觀檢測(cè)組織中不同部位基因表達(dá)的差異。目前單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)主要用于神經(jīng)科學(xué)、生物發(fā)育和腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域，為細(xì)胞功能、表型和組織微環(huán)境中位置的關(guān)系提供了重要信息。

2 單細(xì)胞測(cè)序在肺癌中的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在解析人類(lèi)癌癥細(xì)胞和生物復(fù)雜性方面起到了重要作用，其中許多癌癥是高度異質(zhì)性的，這是因?yàn)槌瞬煌膼盒约?xì)胞亞群外，還有各種基質(zhì)和免疫細(xì)胞類(lèi)型。目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在黑色素瘤[23]、乳腺癌[24]、結(jié)直腸癌[25]等腫瘤中有了廣泛的應(yīng)用，對(duì)肺癌的研究也在不斷深入。

2.1 腫瘤異質(zhì)性 近年來(lái)，人們對(duì)于單個(gè)腫瘤中存在的細(xì)胞多樣性有了一定的了解，但對(duì)于這種異質(zhì)性如何影響腫瘤行為和臨床結(jié)局仍處于萌芽階段[26]。

如果能對(duì)早期肺結(jié)節(jié)的細(xì)胞類(lèi)型和基因圖譜有所了解，那么人們就能更好地理解早期肺癌的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，做到早篩早診早治。Lu等[27]使用scRNA‐seq技術(shù)在單細(xì)胞水平上解析磨玻璃結(jié)節(jié)腺癌（ground glass nodules adenocarcinoma, GGN‐ADC）的全面圖譜，成功鑒定出腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞等8種細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)對(duì)GGN‐ADC中細(xì)胞表型的全面分析，他們對(duì)肺癌的致癌作用有了更深刻的理解，這將有助于今后的預(yù)防和治療。

肺癌的死亡率高和治療預(yù)后差主要在于其異質(zhì)性，為了剖析肺癌的這種異質(zhì)性，Maynard等[28]從30例肺癌患者中，獲取了49份臨床活檢標(biāo)本，這些標(biāo)本分別來(lái)自治療前和治療中。通過(guò)對(duì)比治療前后腫瘤微環(huán)境所發(fā)生的變化，他們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞展現(xiàn)出了極為復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。癌細(xì)胞的scRNA‐seq能比臨床常規(guī)基因檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)更多的靶向癌基因。治療后存活的癌細(xì)胞表現(xiàn)出肺泡細(xì)胞通路活化特征，提示治療可誘導(dǎo)癌細(xì)胞向原始細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這表明癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境會(huì)在抗癌藥的作用下，變得更有可塑性。

2.2 腫瘤微環(huán)境 單細(xì)胞技術(shù)已被用于描述肺癌[29]、乳腺癌[30]、結(jié)直腸癌[31]、頭頸鱗狀細(xì)胞癌[32]等的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME），包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，這是其余方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

腫瘤浸潤(rùn)性髓樣細(xì)胞（tumor‐infiltrating myeloid cells,TIMs）包含單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，已成為癌癥生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。這些細(xì)胞可以多樣化地進(jìn)入多種狀態(tài)，進(jìn)一步促進(jìn)或限制腫瘤的生長(zhǎng)，但是人們對(duì)此知之甚少。單細(xì)胞測(cè)序可以特異性識(shí)別腫瘤微環(huán)境中某一類(lèi)細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)特征。Lavin等[33]利用scRNA‐seq分析18個(gè)肺腺癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境，得到了TREM2、CD81、MARCO、APOE等腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的特征性基因。

Zilionis等[34]使用scRNA‐seq對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）患者的TIMs進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)了25個(gè)TIMs狀態(tài)，其中大多數(shù)在患者中可被重復(fù)發(fā)現(xiàn)。此外，他們還對(duì)小鼠TIMs進(jìn)行了分析。通過(guò)比較物種間的TIM，他們發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的種群結(jié)構(gòu)幾乎完全一致。這表明不同物種的骨髓細(xì)胞高度相似。這項(xiàng)研究為將來(lái)解釋髓系細(xì)胞在癌癥中的確切作用提供理論基礎(chǔ)，TIMs或許可成為免疫治療新靶標(biāo)。

Guo等[29]采用降維聚類(lèi)分析NSCLC患者的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞類(lèi)群的T細(xì)胞耗竭特征基因表達(dá)相對(duì)較低，定義它們?yōu)轭A(yù)耗竭細(xì)胞，并證實(shí)“預(yù)耗竭”與耗竭T細(xì)胞比率高與肺腺癌更好的預(yù)后相關(guān)。同時(shí)，他們還觀察到腫瘤調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Tregs）內(nèi)的異質(zhì)性，其特征是TNFRSF9（抗原特異性Tregs的激活標(biāo)記）的雙峰分布，這些激活的腫瘤Tregs的基因特征與肺腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究治療前后的T細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)，有助于識(shí)別和預(yù)測(cè)接受免疫調(diào)節(jié)劑治療的NSCLC及其他類(lèi)型腫瘤的預(yù)后。

同樣，Lambrechts等[35]通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組探索了肺鱗癌基質(zhì)細(xì)胞的亞群分類(lèi)、基因功能、關(guān)鍵標(biāo)志基因，共鑒定出52個(gè)基質(zhì)細(xì)胞亞群，包括迄今被認(rèn)為是同質(zhì)的不同類(lèi)型的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)腫瘤基質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，反映了腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性。例如，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞下調(diào)免疫細(xì)胞歸巢途徑，腫瘤CD8+T細(xì)胞上調(diào)脂肪酸氧化途徑。因此，腫瘤基質(zhì)的獨(dú)特特征可能成為新穎療法的切入點(diǎn)。

2.3 侵襲和轉(zhuǎn)移 侵襲和轉(zhuǎn)移代表了一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因之一[36]。

Kim等[37]研究了轉(zhuǎn)移性肺腺癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。從44例患者的正常組織或早期或轉(zhuǎn)移癌的208,506個(gè)細(xì)胞中，確定了偏離正常分化軌跡并主導(dǎo)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞亞型。在所有階段，基質(zhì)和免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化創(chuàng)造了促腫瘤和免疫抑制的微環(huán)境。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）是指從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞[38]。CTCs是液體活檢的主要靶點(diǎn)，是腫瘤預(yù)后監(jiān)測(cè)的重要生物標(biāo)志物。研究[39]表明，肺癌患者CTCs數(shù)量與臨床不良預(yù)后相關(guān)?；趩渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)研究肺癌患者的CTC，不僅可以發(fā)現(xiàn)新的CTC生物標(biāo)志物，還可以在分子水平上揭示腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制。Ni等[40]通過(guò)全基因組測(cè)序觀察到特征性的癌癥相關(guān)的單核苷酸變異和CTC外顯子組中的插入/缺失。來(lái)自單個(gè)患者的每個(gè)CTC，無(wú)論癌癥亞型如何，表現(xiàn)出的拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）具有高度一致性，表明CNV與腫瘤的轉(zhuǎn)移可能相關(guān)，為今后基于CNV的肺癌診斷和治療提供思路。

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）因較難獲得組織標(biāo)本無(wú)法直接對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，通過(guò)對(duì)CTC單細(xì)胞測(cè)序或可推斷SCLC進(jìn)化和進(jìn)展。Su等[41]通過(guò)對(duì)化療期間的SCLC患者的CTC進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序來(lái)監(jiān)測(cè)體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)變化（copy number alteration, CNA）?；趩蝹€(gè)CTC建立的CNA評(píng)分是SCLC患者化療后臨床結(jié)局的可能預(yù)測(cè)指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示，與高CNA評(píng)分（≥0）相比，低CNA評(píng)分（<0）的患者在一線化療后的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期均顯著延長(zhǎng)（PFS: 212 d vs 110.5 d, P=0.004,2; OS:223.5 d vs 424 d, P=0.000,6）。

2.4 治療反應(yīng)和耐藥性 盡管采取積極的治療措施，肺癌患者5年生存率仍只有19.8%[42]，一部分患者會(huì)復(fù)發(fā)，甚至發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管一部分復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者可以從免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲益，但大多數(shù)患者預(yù)后很差[43]。人們對(duì)治療失敗的腫瘤分子和遺傳基礎(chǔ)以及患者對(duì)治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)能力的了解仍是初級(jí)的，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可能能夠?qū)ζ溆懈钊氲牧私狻?/p>

Min等[44]分析了從人肺腺癌患者異種移植的34個(gè)單細(xì)胞中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用基因模塊G64進(jìn)行聚類(lèi)分析，G64模塊主要由細(xì)胞周期基因組成。他們發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因模塊G64的上調(diào)/下調(diào)可將34個(gè)單細(xì)胞明確分為兩組，同樣根據(jù)G64模塊的表達(dá)可以將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的488例肺腺癌患者分組。G64模塊的高表達(dá)可能與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

Kim等[45]從1例肺腺癌患者的異種移植瘤中分離出34例患者來(lái)源的異種移植（patient‐derived xenograft, PDX）細(xì)胞。對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行scRNA‐seq基因表達(dá)譜分析和表達(dá)突變譜分析。存活的PDX細(xì)胞上的scRNA‐seq鑒定出與抗癌藥物耐藥性相關(guān)的候選腫瘤細(xì)胞亞群。根據(jù)激活的KRAS突變和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk scores, RS）的預(yù)后價(jià)值，表達(dá)KRASG12D和高RS的PDX細(xì)胞可能是耐藥的。

揭示肺癌內(nèi)部腫瘤細(xì)胞的亞群分布將有助于尋找到具有抗藥能力的亞群，為肺癌患者的個(gè)性化治療提供基礎(chǔ)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞群，從而研發(fā)新的靶向治療藥物。Guo等[29]通過(guò)對(duì)14例NSCLC患者外周血、癌及癌旁組織中的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析鑒定出肺癌T細(xì)胞群體的組成，為特異性靶向T細(xì)胞亞群的免疫治療方法提供了新的靶標(biāo)。

3 總結(jié)與展望

目前進(jìn)行的一系列工作已經(jīng)可以在細(xì)胞水平上定義異質(zhì)性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是研究人類(lèi)腫瘤最先進(jìn)和最廣泛的一種SCS技術(shù)，迄今對(duì)惡性、免疫和基質(zhì)細(xì)胞亞群以及促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞間相互作用具有新穎發(fā)現(xiàn)。通過(guò)了解腫瘤的各個(gè)亞群分布，識(shí)別腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，認(rèn)識(shí)腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成，為今后的臨床研究和個(gè)性化治療提供了指導(dǎo)方向。但是單細(xì)胞測(cè)序仍存在較多的問(wèn)題有待改善，如基因組和轉(zhuǎn)錄組在擴(kuò)增時(shí)應(yīng)盡量提高覆蓋率；降低測(cè)序過(guò)程中的技術(shù)噪音；提高單細(xì)胞的分離水平等?？偟膩?lái)說(shuō)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用必將大大推動(dòng)肺癌研究的進(jìn)一步發(fā)展。