唐彬彬 袁一峰 王申 余陽(yáng) 陳天鵬 劉康 吳連國(guó) 史曉林*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005

2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

原發(fā)性骨質(zhì)疏松(primary osteoporosis，POP)包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的誘因，而老年性骨質(zhì)疏松則與年齡相關(guān)。從骨細(xì)胞代謝來(lái)看，POP是由于骨重建失衡，導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)改變、骨量降低，以致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。2018年，國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布稱骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)已經(jīng)成為我國(guó)50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質(zhì)疏松問題尤為嚴(yán)重[1]。50歲以上人群POP患病率為19.2%，其中女性為32.1%；65歲以上人群POP患病率達(dá)到32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%[1]。因此，開展治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究是十分必要的。

POP是由多種基因-環(huán)境因素等微小作用積累的共同結(jié)果[2]。當(dāng)前，在細(xì)胞-因子層面研究如何防治骨質(zhì)疏松癥的報(bào)道較多，尤其是對(duì)細(xì)胞來(lái)源外泌體(exosomes)的研究。外泌體是一類由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，大小30～140 nm的細(xì)胞外囊泡，包含多種蛋白質(zhì)、RNA、DNA和可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的生物活性脂質(zhì)[3-4]。外泌體不僅可被不同類型的健康或患病細(xì)胞釋放，也可由體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌，包括各種干細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，也存在各種體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。研究表明，外泌體可參與各種疾病的發(fā)展和進(jìn)程。在骨生物中的作用體現(xiàn)在骨組織損傷退變、骨質(zhì)疏松、成骨不全及骨折不愈合等[5-6]。骨質(zhì)疏松方面，外泌體的作用突出，已作為治療OP的新方法，具有極大的治療潛力[7-8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞來(lái)源外泌體可調(diào)節(jié)骨代謝[9-11]，參與骨重建改善POP[12-13]。而外泌體的功能的機(jī)制與microRNA(miRNA)[10，14-16]、long noncoding RNAs(lncRNA)[17-18]有關(guān)。本文將就不同來(lái)源外泌體在POP的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)從成人組織中分離，具有廣泛的增殖和分化成各種細(xì)胞譜系的能力[19]。近年來(lái)，在組織修復(fù)中，MSC的治療機(jī)制發(fā)生了從基于細(xì)胞分化和置換轉(zhuǎn)變?yōu)榛诩?xì)胞分泌和旁分泌信號(hào)[20]。在廣泛的營(yíng)養(yǎng)因子中，MSC來(lái)源外泌體在包括骨缺損和骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種損傷或疾病適應(yīng)證中具有治療效果[19，21-22]。一項(xiàng)包含23項(xiàng)動(dòng)物研究的系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)MSC來(lái)源外泌體促進(jìn)新骨形成，改善骨形態(tài)，抑制骨衰老，并對(duì)成骨細(xì)胞存活、增殖和遷移，形成產(chǎn)生了積極影響[20]。關(guān)于MSC來(lái)源外泌體的促成骨機(jī)制認(rèn)為與外泌體差異表達(dá)的miRNA有關(guān)。miRNA參與并豐富了成骨分化的調(diào)控途徑，比如“Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑”和“內(nèi)吞作用(endocytosis)”[23]。

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是指從人體或動(dòng)物骨髓中分離出來(lái)的一類干細(xì)胞，具有促進(jìn)骨愈合、骨細(xì)胞生長(zhǎng)、骨形成的重要作用。

BMSCs來(lái)源外泌體可抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，改善POP[24-28]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體干預(yù)顯著降低了成骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)的促凋亡蛋白細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶caspase3的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞活力，并減弱了細(xì)胞凋亡[26]。采用BMSCs外泌體抑制Bax/Bcl-2/Caspase凋亡信號(hào)通路，通過干預(yù)卵巢切除(ovariectomized，OVX)小鼠后，發(fā)現(xiàn)血清骨鈣素、骨礦物質(zhì)密度和體積均顯著高于對(duì)照組[27]。Zhao等[25]與Xie等[24]報(bào)道基于MAPK通路，BMSCs來(lái)源外泌體可以促進(jìn)人成骨細(xì)胞系-hFOB1.19細(xì)胞增殖和分化，并下調(diào)相關(guān)凋亡基因。機(jī)制研究揭示了BMSCs外泌體中的miRNA作用較大。MiR-150-3p具有促進(jìn)POP中成骨細(xì)胞的增殖和分化[29]。MiR-29a可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)血管生成及成骨，成為治療POP的潛在靶標(biāo)[30]。BMSCs外泌體中l(wèi)ncRNA-MALAT1(轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄因子1)可結(jié)合miR-34c以促進(jìn)SATB2的表達(dá)，增強(qiáng)OVX小鼠成骨細(xì)胞活性，SATB2具有促進(jìn)成骨分化的作用[31]。然而，miR-21靶向作用SMAD7抑制了相關(guān)成骨因子的表達(dá)，加重POP[32-33]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老齡大鼠BMSCs中miR-31a-5p顯著增加，抑制成骨細(xì)胞分化[34]。上述研究說明BMSCs源性外泌體在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥具有研究意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為原發(fā)性骨質(zhì)疏松具有腎虛、骨痿、髓減的病機(jī)特點(diǎn)，“腎主骨生髓”是防治POP的核心理論，符合BMSCs源性外泌體的作用機(jī)制，這也為中醫(yī)學(xué)治療骨質(zhì)疏松癥提供新思路[35]。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體

研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)來(lái)源外泌體具有刺激骨形成，抑制骨吸收的雙向調(diào)控作用，能通過miRNA介導(dǎo)抑制BMSCs凋亡，減少骨髓內(nèi)脂肪累積，實(shí)現(xiàn)減少骨丟失和維持骨強(qiáng)度的作用[36-38]。研究發(fā)現(xiàn)HUCMSCs來(lái)源外泌體內(nèi)富含成骨蛋白CLEC11 A (C-type lectin domain family 11, member A)，CLEC11 A可以影響破骨細(xì)胞形成，調(diào)節(jié)骨代謝[37]。MiR-1263可結(jié)合Mob1-3'UTR，可激活Hippo通路[39]，最終抑制BMSCs凋亡，預(yù)防OP[38]。MiR-3960可促進(jìn)BMSCs的成骨作用，減少年齡相關(guān)OP的骨流失[36]。

1.3 其他干細(xì)胞來(lái)源外泌體

2017年，Zhu等[40]報(bào)道小鼠脂肪干細(xì)胞來(lái)源外泌體減少骨細(xì)胞的凋亡。近兩年，報(bào)道人尿液干細(xì)胞和人乳牙干細(xì)胞具有相似的作用。Yang等[41]研究發(fā)現(xiàn)人尿來(lái)源干細(xì)胞(urine-derived stem cells，USCs)源性外泌體后可以緩解骨質(zhì)疏松小鼠骨丟失，保持骨強(qiáng)度。外泌體內(nèi)富含CTHRC1(collagen triple-helix repeat containing 1)及骨保護(hù)素，是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞分化所必需的。由于USCs來(lái)源外泌體具有可無(wú)創(chuàng)性采集，不受供體年齡、性別、健康狀況影響的優(yōu)點(diǎn)，有望成為治療POP的新制劑。Sonoda等[42]研究發(fā)現(xiàn)人脫落乳牙(human exfoliated deciduous teeth，SHED)釋放細(xì)胞外外泌體，靶向干預(yù)BMSC的端粒酶活性，并將處理后BMSC移植入OVX小鼠背部皮膚，可促進(jìn)骨質(zhì)疏松小鼠的成骨能力。上述研究均提示人體干細(xì)胞來(lái)源外泌體具有促進(jìn)成骨分化的作用，對(duì)治療POP表現(xiàn)出新的機(jī)制和作用。

2 破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體

破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)來(lái)源外泌體具有促進(jìn)OC分化，調(diào)控破骨和成骨細(xì)胞交流，調(diào)節(jié)骨代謝的作用[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)OC來(lái)源的外泌體可通過傳遞 miR-214-3p 至成骨細(xì)胞中抑制成骨細(xì)胞分化，miR-214-3p 高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠骨形成受到抑制[45]。Zhu等[46]報(bào)道采用磁性羥基磷灰石(MHA)支架可以降低OB攝取外泌體的效率，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。近幾年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型研OC外泌體內(nèi)的miRNA表達(dá)異常，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制成骨分化[47-48]。但對(duì)POP的研究報(bào)道較少，今后可作為一個(gè)新的研究方向。

3 成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體

成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)來(lái)源外泌體也具有抗POP的作用。研究報(bào)道來(lái)自中晚期階段OB的外泌體可顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化，并改善OVX小鼠的骨質(zhì)疏松癥，可運(yùn)用于骨組織工程研究[49]。Tang等[50]報(bào)道成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體miR-433-3p可抑制90%的DKK1蛋白表達(dá)，明顯降低DKK1對(duì)Wnt/β-catenin的抑制作用，來(lái)促進(jìn)OVX小鼠成骨細(xì)胞分化而發(fā)揮作用。然而，報(bào)道在OVX小鼠體內(nèi)注射OB和OB來(lái)源外泌體后發(fā)現(xiàn)，注射OB具有更強(qiáng)的成骨能力[51]。因此，目前關(guān)于OB來(lái)源外泌體的抗POP作用仍在一定的爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

4 肌細(xì)胞來(lái)源外泌體

近年來(lái)，肌肉骨骼被認(rèn)為是內(nèi)分泌器官影響各自的功能，用肌骨“crosstalk”形容它們的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)是通過肌動(dòng)蛋白和骨衍生因子實(shí)現(xiàn)的[52]，可作為用于骨質(zhì)疏松癥和肌少癥的新療法。Takafuji等[53]對(duì)肌骨“crosstalk”的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)C2C12成肌細(xì)胞可分泌外泌體抑制破骨細(xì)胞分化，接著通過miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)C2C12成肌細(xì)胞miR-196a-5p表達(dá)較高，具有抑制破骨細(xì)胞正常功能，增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能的作用[54]。但是，C2C12成肌細(xì)胞外泌體miR-34a則增加了BMSCs的凋亡[55]?；诠趋兰?lái)源外泌體內(nèi)在機(jī)制，也符合中醫(yī)認(rèn)為老年性骨質(zhì)疏松是由于脾腎失司致肌肉骨骼失調(diào)失養(yǎng)引起的[56]。上述研究表明成肌細(xì)胞外泌體是進(jìn)行肌骨相互作用的關(guān)鍵因素，是治療POP的潛在制劑。

5 血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體

據(jù)報(bào)道，血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)在骨穩(wěn)態(tài)中具有一定的作用，但EC外泌體在骨質(zhì)疏松中作用報(bào)道較少。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，僅Song等[57]報(bào)道EC來(lái)源外泌體抑制破骨細(xì)胞的活性，并在OVX小鼠模型中抑制骨質(zhì)疏松，但EC來(lái)源外泌體可被骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMM)內(nèi)化減低作用。通過對(duì)EC外泌體miRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)富含miR-155，遠(yuǎn)超于BMM內(nèi)的miR-155，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞活性。該研究反映了EC外泌體具有抗骨質(zhì)疏松治療潛力。

6 血清來(lái)源外泌體

血清來(lái)源外泌體(serum-derived exosomes，SDEs)對(duì)評(píng)估和診斷OP具有一定的價(jià)值。外泌體miRNA與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。通過對(duì)患者血清外泌體miRNA檢測(cè)，可以及時(shí)預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，進(jìn)而減少脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的早期診斷有著重要意義[58-59]。初步研究發(fā)現(xiàn)OVX小鼠血清外泌體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子高表達(dá)[60]。Huo等[59]開展臨床研究對(duì)骨量正常、骨量減少和骨質(zhì)疏松三類研究對(duì)象進(jìn)行血清外泌體的定量分析，發(fā)現(xiàn)17種蛋白在骨量減少和骨質(zhì)疏松均下調(diào)。Xie等[61]對(duì)骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少的老年患者和正常志愿者血清中的外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者的SDE中的蛋白質(zhì)變化不僅抑制成骨細(xì)胞的機(jī)械感覺和激活，還引發(fā)破骨細(xì)胞的分化和吸收。相反，骨質(zhì)減少患者的SDE的主要變化既促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化，又促進(jìn)新骨質(zhì)的形成，導(dǎo)致骨重塑的代償性升高。正常人SDE可能通過促進(jìn)骨細(xì)胞粘附并抑制衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激而對(duì)骨骼健康起到保護(hù)作用。Ramirez等[62]對(duì)20例骨質(zhì)疏松患者和20例健康婦女的血清外泌體miRNA進(jìn)行研究，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)754個(gè)miRNAs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p和miR-23b-3p作為絕經(jīng)后墨西哥混血兒婦女骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的潛在生物標(biāo)志物。上述研究體現(xiàn)了外泌體及miRNA具有治療骨質(zhì)疏松的作用，說明人血清外泌體開展臨床研究具有可操作性，對(duì)外泌體及miRNA用于臨床治療具有推動(dòng)作用。

7 牛初乳來(lái)源外泌體

牛奶來(lái)源的外泌體能在細(xì)胞間的通訊中起著重要的作用，可治療肥胖、2型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥等疾病[63]。對(duì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松小鼠口服兩個(gè)月乳源性外泌體，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠的骨礦物質(zhì)密度顯著提高[64]。牛初乳中分離出的外泌體可能是預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，改善骨重塑和抑制骨吸收的潛在候選者，對(duì)治療老年性骨質(zhì)疏松癥提供了重要的策略。

8 外泌體研究展望

原發(fā)性骨質(zhì)疏松是最常見的骨代謝疾病，發(fā)病率最高，并發(fā)癥最多。通過對(duì)不同細(xì)胞來(lái)源外泌體的相關(guān)研究進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外泌體治療POP具有巨大的潛力。特別是間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體具有重要的促成骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用，具有研究意義。成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體能為細(xì)胞相互作用構(gòu)建起橋梁，調(diào)節(jié)骨代謝，對(duì)體外研究具有較大意義。肌細(xì)胞外泌體作用的研究，提示肌骨交互可能是治療POP的新靶標(biāo)。人血清來(lái)源外泌體測(cè)定對(duì)骨質(zhì)疏松癥的早期診斷及預(yù)防具有重要意義，可用于臨床研究，同時(shí)對(duì)外泌體及miRNA用于臨床治療具有推動(dòng)作用。與此同時(shí)，應(yīng)重視相關(guān)食物來(lái)源外泌體的抗骨質(zhì)疏松作用，例如牛初乳來(lái)源的外泌體。

綜上所述，本文主要闡述了不同來(lái)源外泌體在防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松方面的應(yīng)用。然而，不同外泌體介導(dǎo)信號(hào)通路中具體分子機(jī)制未十分明確，同類外泌體存在不同作用miRNA的情況。未來(lái)臨床應(yīng)用也面臨著許多尚未解決的問題。但隨著研究的深入，不同外泌體的作用也將逐漸被發(fā)掘，未來(lái)的應(yīng)用前景將十分廣闊。