劉 莉 蔣 萍 戈 偉

泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430050

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，由于結(jié)直腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯且不典型，缺乏特異性，有時(shí)與其他消化系統(tǒng)疾病共存，因此結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，部分患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。而目前臨床上，結(jié)直腸癌的早期篩查往往依賴于糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT），缺乏靈敏度和特異性，容易導(dǎo)致漏檢和過(guò)度檢測(cè)，臨床中急需開(kāi)發(fā)高特異性的篩查方法[1]。同時(shí)，結(jié)直腸癌治療手段仍有限，診療效果一定程度上取決于高效精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案的制訂。因此，對(duì)腫瘤的分子遺傳信息的動(dòng)態(tài)掌握成為了結(jié)直腸癌診治的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由腫瘤細(xì)胞釋放到血漿中的單鏈或者雙鏈DNA 片段，攜帶有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學(xué)信息。ctDNA 液態(tài)活檢技術(shù)具有無(wú)創(chuàng)、能夠?qū)崟r(shí)反映腫瘤基因組信息、特異性高、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)δ[瘤患者的病程發(fā)展及治療進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。由此，ctDNA 逐漸成為了癌癥預(yù)防、診斷、治療研究的一大熱點(diǎn)[2]。目前，基于ctDNA的結(jié)直腸癌檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、磁珠乳液擴(kuò)增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）、下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）等[3]。下面將從ctDNA檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查中的應(yīng)用，在分子診斷與用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用以及預(yù)后評(píng)估等多方面展開(kāi)綜述。

1 ctDNA 在結(jié)直腸癌早期篩查中的應(yīng)用

根據(jù)最新腫瘤流行病學(xué)研究顯示，我國(guó)結(jié)直腸癌Ⅰ期和Ⅱ期的5 年生存率分別為90%和70%，而Ⅲ期和Ⅳ期結(jié)直腸癌患者5 年生存率僅有50%和10%[4]。因此，針對(duì)高齡、吸煙、長(zhǎng)期高脂飲食、具有結(jié)直腸癌家族史，患有炎癥性腸病等高危人群開(kāi)展結(jié)直腸癌的早期篩查，開(kāi)展有效的腫瘤二級(jí)預(yù)防具有重要意義，可降低結(jié)直腸癌的死亡率[5-6]。目前，我國(guó)結(jié)直腸癌的早期篩查方法主要有直腸指檢、FOBT 和腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，CA19-9）檢測(cè)等，然而這些檢測(cè)方法靈敏度和特異性均有限[7]。而作為診斷結(jié)直腸癌金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)腸鏡作為一項(xiàng)高成本、患者依從性較差、且具有潛在風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥的檢查，難以成為民眾早期篩查的工具[8]。得益于ctDNA的液態(tài)活檢技術(shù)具有高靈敏度和非侵入性等特點(diǎn)，使其有望成為結(jié)直腸癌早期篩查的理想選擇[9]。有研究表明，通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌相關(guān)的關(guān)鍵基因的ctDNA的突變情況、甲基化水平、羥甲基化水平等，可有效做到結(jié)直腸癌的早期篩查[10]。

1.1 ctDNA 基因甲基化水平檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查中的應(yīng)用

研究指出，與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的基因甲基化水平變化往往早于相關(guān)基因突變的發(fā)生，即在癌癥早期。因此，結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的基因的甲基化水平的檢測(cè)，可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期篩查和診斷[11]。近年來(lái)研究報(bào)道中關(guān)于結(jié)直腸癌早期篩查常用的甲基化基因 標(biāo) 志 物 有：SEPT9、SDC2、SFRP2、ALX4、TMEFF2、NGFR、p14、p16、APC、BCAT1、IKZF1、DAPK、HLTF、hMLH1、MGMT、RARβ2、RASSF2A、WIF-1、VIM、BMP3、NPTX2、RARB 等[12-13]，其中SEPT9 是一種抑癌基因，位于17 號(hào)染色體q25.3，編碼GTP 結(jié)合蛋白，其主要功能是調(diào)控細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分裂，多數(shù)結(jié)直腸癌患者存在該基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平升高，進(jìn)而引發(fā)異常的細(xì)胞分裂誘發(fā)癌變。目前，SEPT9 甲基化水平檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度可達(dá)69%，特異性達(dá)92%，相關(guān)檢測(cè)試劑盒已于2016 年被美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，國(guó)內(nèi)也已有相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[14-15]。2020 年最新研究基于機(jī)器學(xué)習(xí)的生物信息學(xué)算法篩選出的cg10673833 位點(diǎn)，其甲基化水平可以作為結(jié)直腸癌和癌前病變，晚期腺瘤的檢測(cè)標(biāo)志物。對(duì)1493例結(jié)直腸癌高危人群開(kāi)展檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)89.7%，特異性達(dá)86.8%[16]。

然而，單一位點(diǎn)甲基化檢測(cè)的靈敏度和特異性仍有限，研究表明，檢測(cè)多個(gè)結(jié)直腸癌關(guān)鍵基因位點(diǎn)的甲基化水平可增強(qiáng)結(jié)直腸癌的早期篩查的靈敏度和特異性[17]。例如，采用qPCR的方法聯(lián)合檢測(cè)SEPT9和SDC2 甲基化水平，晚期腺瘤和Ⅰ期腸癌的檢測(cè)靈敏度分別提升至47.8%和80.0%，全部分期的結(jié)直腸癌檢測(cè)靈敏度達(dá)88.9%，特異性達(dá)92.8%[18]；聯(lián)合檢測(cè)ctDNA 中SDC2 和SFRP2 甲基化水平，結(jié)直腸癌檢測(cè)靈敏度達(dá)76.2%，特異性達(dá)87.9%[19]；聯(lián)合檢測(cè)ctDNA中C9orf50、KCNQ5、CLIP4 3 個(gè)基因的甲基化水平，檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度達(dá)78%，特異性達(dá)99%[20]。

1.2 ctDNA 羥甲基化水平、突變、拷貝數(shù)變異等其他檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查中的應(yīng)用

DNA的羥甲基化也是表觀遺傳學(xué)的重要修飾，其與基因調(diào)控和腫瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)，是近年來(lái)新興的檢測(cè)技術(shù)，推動(dòng)了結(jié)直腸癌的早期篩查，靈敏度可達(dá)83%。特異性可達(dá)94%[21-23]。

近年來(lái)也有檢測(cè)相關(guān)基因突變來(lái)篩查早期癌癥的相關(guān)報(bào)道，但由于單獨(dú)檢測(cè)突變往往不能做到很好的預(yù)測(cè)，早期癌癥和癌前病變往往相關(guān)突變頻率較低，且ctDNA 含量也較低，檢出率低，靈敏度較低，容易導(dǎo)致漏檢。聯(lián)合檢測(cè)相關(guān)基因突變和蛋白標(biāo)志物的cancerseek 技術(shù)可用于多種癌癥的早期篩查，其中，結(jié)直腸癌的cancerseek 靈敏度達(dá)64.9%，特異性達(dá)99.1%[24]。

基因組不穩(wěn)定性，特別是拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是癌癥的一個(gè)特征，已被證明具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)也可以對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行預(yù)測(cè)，靈敏度為91.7%，特異性為88.9%[25]。

綜上，隨著更大樣本數(shù)量的大規(guī)模研究開(kāi)展，高效的結(jié)直腸癌早篩檢測(cè)基因標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，PCR、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和NGS 等技術(shù)的不斷發(fā)展和革新，使得更加便捷、高靈敏度和特異性的ctDNA 檢測(cè)手段和體外診斷產(chǎn)品（in vitro diagnostic products，IVD）將走向臨床，得益于目前新興的生物信息學(xué)算法的引入，以上發(fā)展將在一定程度上降低結(jié)直腸癌的死亡率，以期達(dá)到結(jié)直腸癌早診早治的目的。

2 ctDNA 在結(jié)直腸癌分子診斷和用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用

目前，針對(duì)結(jié)直腸癌的確診主要依賴于結(jié)直腸鏡和病理學(xué)檢測(cè)，針對(duì)結(jié)直腸癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。對(duì)于結(jié)直腸癌患者，特別是針對(duì)中晚期原發(fā)性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，取得組織樣本較為困難，因此，采用基于ctDNA的液態(tài)活檢策略檢測(cè)RAS（KRAS、NRAS、HRAS），BRAF，HER2（ERBB2），EGFR，TP53，PIK3CA，APC，MET，GNAS 等基因突變，評(píng)估微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，對(duì)結(jié)直腸癌的分子診斷和個(gè)體化用藥指導(dǎo)具有重要意義[26-27]。

2.1 ctDNA RAS 基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌分子診斷和用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用

在多種突變中，RAS 相關(guān)基因的突變檢測(cè)對(duì)靶向治療的選擇有著決定性的作用，其中KRAS 是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）下游信號(hào)通路的重要效應(yīng)因子，主要激活RAF-MAPK通路，參與生長(zhǎng)調(diào)控，在抗細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用[28]。存在KRAS 和NRAS 基因突變的患者往往對(duì)EGFR 抑制劑（如西妥昔單抗）不敏感，其中約有40%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者存在KRAS突變，以發(fā)生在右側(cè)結(jié)腸癌者為主，有4%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者存在NRAS 突變，以發(fā)生在左側(cè)結(jié)腸癌的女性患者為主。KRAS 突變中，2 號(hào)外顯子突變發(fā)生率最高，主要發(fā)生在12 號(hào)和13 號(hào)密碼子，例如，2 號(hào)外顯子G12C、G13D 突變預(yù)示著較差的預(yù)后，G12D、G12V 則與預(yù)后相關(guān)性不大。KRAS的3 號(hào)和4 號(hào)外顯子，以及NRAS的2、3、4 號(hào)外顯子突變患者對(duì)EGFR抑制劑響應(yīng)也較差[29]。

因此，在結(jié)直腸癌患者中開(kāi)展RAS 相關(guān)基因突變的檢測(cè)對(duì)診療中EGFR 抑制劑的使用起到指導(dǎo)性作用。

2.2 ctDNA 其他基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌分子診斷和用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用

BRAF 基因是RAS 基因下游一種絲氨酸蘇氨酸激酶基因，BRAF的激活在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，該基因突變導(dǎo)致MAPK 信號(hào)通路活化，誘發(fā)癌癥發(fā)生。該基因中V600E 突變常發(fā)現(xiàn)于女性和年老者，存在該基因突變者可能對(duì)西妥昔單抗耐藥，對(duì)治療及預(yù)后產(chǎn)生不利影響[30]。KLF4 基因的A472D突變也會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)EGFR 抑制劑耐藥，其與下游EGFR 蛋白磷酸化增強(qiáng)有關(guān)[31]。NTRK1 基因G595R 和G667C 突變導(dǎo)致了結(jié)直腸癌患者對(duì)廣譜抗癌藥TRK抑制劑恩曲替尼的耐藥[32]。

因此，對(duì)于不存在RAS 和BRAF 等相關(guān)基因突變的結(jié)直腸癌患者，可考慮聯(lián)合使用化療藥物和EGFR抑制劑及抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular en dothelial growth factor，VGFR）抑制劑，以期獲得最大獲益[33]。

由于結(jié)直腸癌一般對(duì)常規(guī)化療欠敏感，早期患者根治術(shù)后一般不需要化療，在中晚期手術(shù)前減低腫瘤大小，降低分期，以及促進(jìn)術(shù)后康復(fù)，臨床中氟尿嘧啶、亞葉酸鈣、奧沙利鉑三聯(lián)用藥是常規(guī)的化療方案；而對(duì)于高度的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的患者，在Ⅱ期術(shù)后，單藥氟尿嘧啶類藥物不獲益，則可采用免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)抑制劑納武單抗[34-35]。因此，評(píng)估微衛(wèi)星穩(wěn)定性對(duì)于是否采取常規(guī)化療和免疫治療具有指導(dǎo)意義。

隨著更多靶向藥物、免疫治療藥物的開(kāi)發(fā)和上市，利用動(dòng)態(tài)ctDNA 針對(duì)結(jié)直腸癌相關(guān)基因位點(diǎn)的突變檢測(cè)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的評(píng)估，將為中晚期結(jié)直腸癌的用藥提供重要指導(dǎo)。同時(shí)更多關(guān)鍵有意義的基因突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，也將為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供更多藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)，助力抗腫瘤藥物的發(fā)展。

3 ctDNA 在結(jié)直腸癌預(yù)后判斷中的應(yīng)用

結(jié)直腸癌明確診斷和接受相關(guān)治療后，其療效的預(yù)后評(píng)估和治療策略的及時(shí)調(diào)整在康復(fù)、延長(zhǎng)生存時(shí)間、降低死亡率等方面是至關(guān)重要的。ctDNA 在結(jié)直腸癌預(yù)后中的效果明顯優(yōu)于其他影像學(xué)檢測(cè)和腫瘤蛋白標(biāo)志物檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)后血漿ctDNA 中APC、TP53 和KRAS 等基因突變情況來(lái)判斷腫瘤復(fù)發(fā)，其靈敏度和特異性均可達(dá)100%[36]。聯(lián)合檢測(cè)BCAT1、IKZF1 甲基化在檢測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的靈敏度上明顯優(yōu)于CEA 檢測(cè)[37]?；颊咴诮邮芙Y(jié)直腸癌切除術(shù)或接受其他治療方案（如輔助化療，靶向治療，免疫治療）后，開(kāi)展基于ctDNA的液態(tài)活檢，可以提早、特異性地檢測(cè)到微小轉(zhuǎn)移灶，有效地預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，又能避免部分術(shù)后治愈的患者接受過(guò)度的輔助治療。

此外，對(duì)于接受化療和靶向治療的患者，如在藥物使用過(guò)程中出現(xiàn)不利的基因突變時(shí)可以及時(shí)更換療法，減少毒副作用，避免延誤治療時(shí)機(jī)，做到精準(zhǔn)調(diào)整治療策略[38-40]。在接受靶向藥物治療后的耐藥分析中，KRAS、BRAF、EGFR 等基因突變頻率的改變及新發(fā)突變都意味著可能發(fā)生耐藥和預(yù)后較差[41-42]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織KRAS 野生型的結(jié)直腸癌患者中使用靶向EGFR的治療藥物，部分耐藥患者的ctDNA中檢出KRAS 突變。出現(xiàn)以上結(jié)果的可能解釋有兩種，一是藥物的選擇性篩選作用，在原發(fā)腫瘤組織中本身存在極低頻的突變，因檢測(cè)技術(shù)靈敏度有限未檢出，而靶向藥物治療過(guò)程中選擇性地殺死了未發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞，殘存了含有KRAS 突變的腫瘤細(xì)胞則生長(zhǎng)，進(jìn)而在血液中被檢出。另一種解釋為獲得性突變，即在靶向藥物治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)或抵抗藥物所致的生存環(huán)境的惡劣變化，獲得新的突變。這些解釋在其他研究工作中得到了證實(shí)[43-44]。

因此，針對(duì)結(jié)直腸癌患者治療后開(kāi)展ctDNA 檢測(cè)，能夠使臨床醫(yī)生及時(shí)獲得可能對(duì)患者具有前瞻性或者隨訪有用的信息，對(duì)不利的結(jié)果可以做到及時(shí)干預(yù)，最大可能延長(zhǎng)患者生存期。

4 總結(jié)與展望

基于ctDNA 檢測(cè)的液態(tài)活檢技術(shù)在結(jié)直腸癌早期篩查、分子分型，檢測(cè)術(shù)后微小殘留、用藥指導(dǎo)、預(yù)測(cè)治療效果、監(jiān)測(cè)耐藥、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等多方面，具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)和克服腫瘤異質(zhì)性等多種優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)技術(shù)上，隨著qPCR、ddPCR、NGS 等大量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，提高了其檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度；隨著檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)發(fā)展，分子標(biāo)簽UMI的引入克服了低分子量和標(biāo)簽跳躍等技術(shù)問(wèn)題；隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，分子生物學(xué)等多基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展，更多關(guān)鍵標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，基于ctDNA的結(jié)直腸癌液態(tài)活檢將不斷推動(dòng)臨床診療的不同層面發(fā)展和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)，更好地為腫瘤高危人群提供檢測(cè)服務(wù)，為腫瘤患者提供更精準(zhǔn)的個(gè)性化治療策略。