竇勇，姚妙愛，閭懷中，胡佩紅，董靜

冷等離子體對(duì)單核增生李斯特菌的殺菌機(jī)理

竇勇1，姚妙愛1，閭懷中1，胡佩紅2，董靜1

（1江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食工程與食品藥品學(xué)院，江蘇淮安 223003；2淮安正昌飼料有限公司，江蘇淮安 223003）

【】作為一種新興的非熱滅菌技術(shù)，冷等離子在食品行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。通過探討冷等離子體對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞效果，闡述其抗菌機(jī)制，為冷等離子體在食品行業(yè)的應(yīng)用提供參考。本研究以單核增生李斯特菌（，LM）為試驗(yàn)菌株，研究冷等離子體處理對(duì)LM形態(tài)和胞內(nèi)物質(zhì)的影響，闡述LM細(xì)胞膜完整性的變化；冷等離子體處理后，通過測(cè)定細(xì)胞膜脂肪酸含量和類型的變化，比較8-苯胺-1-萘磺酸熒光強(qiáng)度的改變，反映冷等離子體對(duì)LM細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響。通過測(cè)定碘化丙啶熒光、電導(dǎo)率和-半乳糖苷酶活性的變化，觀察冷等離子體對(duì)LM細(xì)胞膜通透性的改變。最后，通過檢測(cè)胞內(nèi)活性氧和活性氧相關(guān)基因表達(dá)量的變化，闡明冷等離子體對(duì)LM細(xì)胞膜造成的氧化損傷。冷等離子體處理后，LM細(xì)胞膜表面觀察到破損變形的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA分別下降了68 mg?mL-1和14 μg?mL-1，證明冷等離子體破壞了細(xì)胞膜的完整性。冷等離子體處理使LM細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量從40.17%上升至53.91%，飽和脂肪酸的含量從53.68%下降到41.57%，8-苯胺-1-萘磺酸熒光強(qiáng)度從8.99下降到3.73，說明冷等離子體處理后細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加。此外，冷等離子體處理后，碘化丙啶可以透過細(xì)胞膜，與胞內(nèi)遺傳物質(zhì)結(jié)合發(fā)出紅色熒光，電導(dǎo)率由0.15 mS?cm-1上升至0.33 mS?cm-1，-半乳糖苷酶活性也發(fā)生了明顯的變化，OD420nm從0.274提高至0.683，說明LM細(xì)胞膜通透性提高。胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）熒光和熒光強(qiáng)度的變化說明，冷等離子體刺激細(xì)胞膜上ROS的產(chǎn)生，因此對(duì)細(xì)胞膜造成了氧化損傷。qRT-PCR結(jié)果顯示冷等離子體處理下調(diào)了和的相對(duì)表達(dá)量，分別下降43.29%和52.71%，而的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了89.42%，揭示冷等離子體處理?xiàng)l件下，微生物在基因?qū)用娴难趸瘧?yīng)激和調(diào)控機(jī)制。冷等離子體的活性基團(tuán)通過對(duì)細(xì)胞膜的作用，破壞LM的細(xì)胞活性，起到了抑制效果。

冷等離子體；單核增生李斯特菌；細(xì)胞膜；流動(dòng)性；氧化損傷

0 引言

【研究意義】單核增生李斯特菌（，LM）是一種常見的人畜共患病革蘭氏陽(yáng)性致病菌，因耐低溫（4℃）、抗堿鹽以及抗高滲透壓特性使其普遍存在于食品表面和環(huán)境中，對(duì)食品安全和人類健康造成了巨大的威脅[1]。傳統(tǒng)的熱殺菌技術(shù)包括巴氏殺菌、高溫瞬時(shí)殺菌和微波殺菌法等是食品行業(yè)中常用的控制LM污染的方法，然而，這些熱殺菌技術(shù)由于溫度的升高，對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味等造成了一定的影響[2]。因此，尋找一種有效的冷殺菌技術(shù)，研究其潛在的抗菌機(jī)制，對(duì)食品行業(yè)中LM的控制有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】目前，已經(jīng)有研究人員應(yīng)用不同的冷殺菌技術(shù)控制食品中微生物的繁殖，包括脈沖強(qiáng)光[3]、超高壓[4]、超聲波[5]和冷等離子體技術(shù)等，其中，冷等離子體殺菌技術(shù)因操作裝置簡(jiǎn)單，不會(huì)引起處理樣品升溫，已在食品領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用[6]。冷等離子體對(duì)LM的殺菌效果已經(jīng)得到了很多研究的驗(yàn)證，如Kim等[7]利用介質(zhì)阻擋放電冷等離子體技術(shù)處理豬排，發(fā)現(xiàn)處理后豬排中的李斯特菌數(shù)量明顯降低；李兆杰等[8]發(fā)現(xiàn)，在功率為120 W、電壓10 kV和頻率30—40 kHz條件下，4 min的冷等離子處理可以徹底殺滅LM。此外，冷等離子體對(duì)微生物作用機(jī)制也得到了初步研究，如LIN等[9]發(fā)現(xiàn)冷等離子體的活性成分能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌的新陳代謝、胞內(nèi)蛋白、多糖和DNA的含量，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。細(xì)胞膜是隔離細(xì)菌與外部環(huán)境的重要屏障，對(duì)維持細(xì)菌的生理功能和外觀形態(tài)起著重要的作用。遭遇外部壓力和抗菌處理時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜作為主要的作用位點(diǎn)，完整性、流動(dòng)性和通透性會(huì)發(fā)生明顯的改變，從而影響胞內(nèi)物質(zhì)如DNA、ATP、蛋白質(zhì)和酶以及物質(zhì)運(yùn)輸與信息交流[10]。同時(shí)，細(xì)胞膜是胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，一些環(huán)境因素如輻照、紫外線處理和脈沖照射等都會(huì)刺激胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，從而激活氧化壓力造成細(xì)胞膜的氧化損傷[11]。為了感知和應(yīng)對(duì)胞內(nèi)活性氧造成的氧化損傷，LM已經(jīng)進(jìn)化出一些復(fù)雜的氧化還原調(diào)節(jié)基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管冷等離子體對(duì)LM的殺菌效果已經(jīng)得到了廣泛的驗(yàn)證，但是冷等離子體對(duì)LM的殺菌機(jī)制卻鮮有研究，尤其是冷等離子體基于細(xì)胞膜層面的破壞機(jī)制還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以LM為研究對(duì)象，優(yōu)化冷氮源等離子體對(duì)LM的最佳抑制條件，從細(xì)胞膜層面揭示冷氮源等離子體的殺菌機(jī)制，研究其對(duì)細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性和通透性的影響（圖1）。此外，通過研究冷等離子體對(duì)細(xì)胞膜引起的氧化損傷以及對(duì)氧化還原相關(guān)基因表達(dá)的影響，為拓展冷等離子體的抗菌應(yīng)用提供參考。

圖1 冷等離子體對(duì)細(xì)胞膜的作用機(jī)制示意圖

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CMCC（B）54002單核增生李斯特菌由豐暉生物科技有限公司提供，斜面保藏的細(xì)菌接種至液體蛋白胨酵母浸膏葡萄糖培養(yǎng)基中（PYG），37℃培養(yǎng)48 h到達(dá)對(duì)數(shù)期；蛋白檢測(cè)試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，美國(guó)Sigma公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）、碘化丙啶（PI）、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH- DA）、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）、鄰-硝基苯--d-半乳糖苷（ONPG），上海阿拉丁生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

介質(zhì)阻擋放電（DBD）冷等離子體裝置，蘇州ATV電子技術(shù)有限公司；透射電子顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；蛋白電泳儀、核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯；電子自旋共振儀，德國(guó)布魯克公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 冷等離子體最佳抑制條件的優(yōu)化 將對(duì)數(shù)期的LM菌懸液稀釋后，加入到無(wú)菌PYG液體培養(yǎng)基中（總體積5 mL），菌體初始濃度為5.6 CFU/mL。隨后立即置于冷等離子體設(shè)備中進(jìn)行處理。使用氮?dú)鉃榧ぐl(fā)氣體，功率（180、200和220 W）、處理時(shí)間（50、60和70 s）和氮?dú)饬魉伲?0、50和60 cm3?min-1）為因素，殘存菌數(shù)為因變量，應(yīng)用Design Expert軟件進(jìn)行冷等離子體最佳抑菌條件（處理前后菌落數(shù)量變化最?。┑膬?yōu)化，優(yōu)化后的條件用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞膜的完整性

1.3.2.1 透射電子顯微鏡觀察 冷等離子體處理后，對(duì)數(shù)期的LM菌懸液（試驗(yàn)組，～108—109CFU/mL）滴于銅網(wǎng)上面，與3%（v﹕v）的磷鎢酸溶液混合染色5 min，晾干，使用透射電子顯微鏡觀察冷等離子體對(duì)LM細(xì)胞膜完整性的影響[12]。未經(jīng)冷等離子體處理的LM菌懸液作為對(duì)照組。

1.3.2.2 胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏 細(xì)胞膜的完整性也可以用胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)和DNA的泄漏來反映。蛋白質(zhì)的泄漏使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)濃度的變化來檢測(cè)。冷等離子體處理后，對(duì)數(shù)期的LM菌懸液（～108—109CFU/mL）離心、洗滌，收集菌體沉淀后重懸在1 mL的無(wú)菌PBS中。重懸液使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破胞，離心，取上清液與4×上樣緩沖液沸水浴中煮沸10 min。冷卻后，加樣到蛋白電泳儀中，80 V條件下泳動(dòng)20 min后，調(diào)整電壓至120 V進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)[13]。至于蛋白質(zhì)濃度的變化，將經(jīng)過冷等離子體處理后的LM菌懸液離心、洗滌和重懸后，其蛋白質(zhì)含量使用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。未經(jīng)冷等離子體處理的LM菌懸液作為對(duì)照組。

1.3.2.3 胞內(nèi)DNA的泄漏 冷等離子體處理（試驗(yàn)組）和未處理（對(duì)照組）的LM菌懸液（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）經(jīng)離心、洗滌和重懸后，用基因組DNA提取試劑盒提取其中的DNA。使用紫外可見分光光度計(jì)在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同樣品中DNA含量的變化[14]。

1.3.3 細(xì)胞膜的流動(dòng)性

1.3.3.1 細(xì)胞膜脂肪酸的變化 試驗(yàn)組和對(duì)照組的LM（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）經(jīng)離心洗滌后收集菌體沉淀，菌體沉淀置于冷凍干燥機(jī)干燥24 h。稱取1 g干燥后LM加入35 mL的甲醇/氯仿（v﹕v，1﹕2）溶液，超聲30 min，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行氮吹，所得提取物即為磷脂。提取得到的磷脂加入2 mL的甲基化試劑（2 mol?L-1NaOH-CH3OH），75℃加熱20 min，將磷脂中的脂肪酸甲酯化[15]。脂肪酸甲酯用正己烷萃取，加樣到氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）中，分析脂肪酸組分和含量的變化。GC-MS條件為：注射溫度250℃，檢測(cè)溫度260℃，程序升溫60℃保持3 min，5℃?min-1加熱到160℃，2℃?min-1加熱至220℃，然后10℃?min-1加熱到230℃并保持2 min。

1.3.3.2 1-苯胺-8-萘磺酸 （ANS）熒光 4 mL冷等離子體處理的LM菌懸液（試驗(yàn)組，～106CFU/mL）與20 μL的ANS溶液（8 mmol?L-1）混合，置于暗處反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，置于熒光分光光度計(jì)中，385 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和473 nm的發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度[16]。未經(jīng)等離子體處理的LM作為對(duì)照組。

1.3.4 細(xì)胞膜的通透性

1.3.4.1 碘化丙啶（PI）熒光 20 μL的PI溶液（20 mmol?L-1）與4 mL冷等離子體處理的LM菌懸液（～106CFU/mL）混合，置于暗處反應(yīng)30 min。使用倒置熒光顯微鏡獲取不同樣品的PI熒光照片，激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm[17]。未經(jīng)等離子體處理的LM作為對(duì)照組。

1.3.4.2 電導(dǎo)率 不同處理的LM菌懸液（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）離心后收集上清液。不同樣品上清液的電導(dǎo)率由電導(dǎo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.3 β-半乳糖苷酶活性 使用乳糖類似物鄰-硝基苯--d-半乳糖苷（ONPG）檢測(cè)細(xì)胞膜上-半乳糖苷酶活性的變化。將不同的LM菌懸液（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）離心、洗滌和重懸后，加入ONPG溶液（30 mmol?L-1，體積比1﹕20），置于暗處反應(yīng)30 min。在420 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)不同樣品的紫外分光光度值[18]。

1.3.5 細(xì)胞膜的氧化損傷

1.3.5.1 胞內(nèi)活性氧（ROS）熒光照片和熒光強(qiáng)度 使用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）檢測(cè)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。5 mL的LM菌懸液（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）經(jīng)離心洗滌后收集菌體沉淀。菌體沉淀重懸于2 mL的DCFH-DA（10 μmol?L-1）溶液中，置于暗處反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即置于冷等離子體裝置中處理（試驗(yàn)組）。處理結(jié)束后，離心洗滌并重懸于等體積的PBS溶液中。使用倒置熒光顯微鏡在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)處獲取不同樣品的熒光照片。不同樣品的ROS熒光強(qiáng)度則用熒光分光光度計(jì)在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)。

1.3.5.2 電子自旋共振（ESR） 使用電子自旋共振儀檢測(cè)ROS的種類。冷等離子體處理后，100 μL的LM菌懸液（對(duì)數(shù)期，～108—109CFU/mL）與20 μL 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）混合，置于暗處反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后移入毛細(xì)管中，在ESR儀器中檢測(cè)。檢測(cè)條件為：中心場(chǎng)強(qiáng)3 510 G，掃描寬度100 G，頻率9.85 GHz[19]。

1.3.5.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 使用qRT-PCR檢測(cè)氧化還原相關(guān)基因和表達(dá)量的變化。不同LM樣品的總RNA用RNA提取試劑盒提取。提取的RNA用逆轉(zhuǎn)率試劑盒來合成cDNA。合成的cDNA作為qRT-PCR反應(yīng)的模板來檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量的變化[20]。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。16S內(nèi)參基因和相關(guān)基因的引物序列如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)在3次測(cè)試后以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用SPSS軟件中的單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，<0.05為差異顯著。使用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果的處理。

2 結(jié)果

2.1 冷等離子體最佳抑制條件的優(yōu)化和細(xì)胞膜完整性變化

由響應(yīng)面分析法得出的最佳抑制條件是：功率182 W，處理時(shí)間67 s，氮?dú)饬魉?2 cm3?min-1（圖2），用此條件作為后續(xù)的全部試驗(yàn)。

未經(jīng)冷等離子體處理的LM表面光滑，飽滿圓潤(rùn)，有完整的細(xì)胞膜包裹在細(xì)菌的外面（圖3-A）。但經(jīng)過冷等離子體處理后，LM細(xì)胞膜表面觀察到破損變形的結(jié)構(gòu)和泄漏的胞內(nèi)物質(zhì)（圖3-B），說明冷等離子體能夠?qū)е翷M細(xì)胞膜完整性的破壞和變形。

表1 不同基因的引物序列

圖2 功率、處理時(shí)間和氣體流速影響等離子體抑制效果的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏也可以反映細(xì)胞膜完整性的破壞。由圖3-C可知，經(jīng)冷等離子體處理后（試驗(yàn)組），蛋白質(zhì)條帶的亮度低于對(duì)照組，說明冷等離子體導(dǎo)致了胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏。經(jīng)等離子體處理后，LM內(nèi)部的蛋白質(zhì)含量從157 mg?mL-1（對(duì)照組）下降到89 mg?mL-1（試驗(yàn)組），胞內(nèi)蛋白質(zhì)出現(xiàn)了明顯的泄漏（圖3-D）。同樣，經(jīng)過冷等離子體處理后，胞內(nèi)DNA的含量也發(fā)生了明顯的變化。DNA含量從35 μg?mL-1（對(duì)照組）下降到21 μg?mL-1（試驗(yàn)組）。以上LM形態(tài)觀察和胞內(nèi)物質(zhì)的檢測(cè)說明冷等離子體破壞了細(xì)胞膜的完整性。

A：對(duì)照組的TEM圖；B：試驗(yàn)組的TEM圖；C：不同樣品的SDS-PAGE結(jié)果；D：不同樣品的蛋白質(zhì)含量變化；E：不同樣品DNA含量變化。*表示試驗(yàn)組和對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。下同

2.2 細(xì)胞膜的流動(dòng)性

2.2.1 細(xì)胞膜脂肪酸分析 細(xì)胞膜的流動(dòng)性對(duì)細(xì)菌的活性和生命力起到了至關(guān)重要的作用。細(xì)胞膜磷脂中不飽和脂肪酸含量的變化是預(yù)測(cè)細(xì)胞膜流動(dòng)性變化的重要指標(biāo)，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量越高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性也就越大[21]。由表2可知，經(jīng)過冷等離子體處理后（試驗(yàn)組），細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量達(dá)到53.91%，比對(duì)照組高40.17%。同時(shí)，經(jīng)過冷等離子體處理后，飽和脂肪酸的含量從53.68%下降到41.57%。說明經(jīng)冷等離子體處理后，LM細(xì)胞膜的流動(dòng)性明顯增加。此外，經(jīng)冷等離子體處理后，短鏈脂肪酸（C12和C14）的含量增加到8.13%。有研究表明短鏈脂肪酸含量的增加能夠提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性[22]，本研究結(jié)果說明冷等離子體處理提高了LM的膜流動(dòng)性。

表2 不同樣品的脂肪酸成分和含量

同一行中不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）

Different letters in the same line means significant difference (<0.05)

2.2.2 ANS熒光 ANS熒光探針可以用來測(cè)定細(xì)胞膜的流動(dòng)性。ANS能夠和細(xì)胞膜的疏水區(qū)域結(jié)合，細(xì)胞膜的流動(dòng)性越小，ANS就越容易與細(xì)胞膜結(jié)合，進(jìn)而熒光強(qiáng)度也越高[23]。本研究利用ANS熒光強(qiáng)度的變化來反映細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變，由圖4可知，試驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，從8.99下降到3.73，說明冷等離子體處理后細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加。

2.3 細(xì)胞膜的通透性

2.3.1 PI熒光 碘化丙啶（PI）是一種膜不透性的熒光探針，能夠與細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)結(jié)合，發(fā)射出紅色熒光。PI不能穿透完整的細(xì)胞膜，只有細(xì)胞膜的通透性提高后，PI才能進(jìn)入細(xì)胞并與遺傳物質(zhì)結(jié)合[24]。因此，通過檢測(cè)PI熒光反映細(xì)胞膜通透性的變化。圖5-A中沒有檢測(cè)到紅色的熒光，說明PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，進(jìn)而不能和遺傳物質(zhì)結(jié)合。圖5-B中觀察到大量的紅色熒光，說明冷等離子體處理后，細(xì)胞膜的通透性提高，大量的PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與遺傳物質(zhì)結(jié)合發(fā)射出紅色的熒光。

圖4 不同樣品的ANS熒光

2.3.2 電導(dǎo)率和-半乳糖苷酶活性 細(xì)胞膜通透性的提高能夠促進(jìn)電解質(zhì)和胞內(nèi)離子的泄漏，進(jìn)而提高菌懸液的電導(dǎo)率。由圖5-C可以看出，對(duì)照組的電導(dǎo)率為0.15 mS?cm，低于試驗(yàn)組的0.33 mS?cm，說明冷等離子體處理后細(xì)胞膜通透性的提高。-半乳糖苷酶是一種位于細(xì)胞膜上的水解酶，能夠水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。ONPG是一種乳糖類似物，能夠被-半乳糖苷酶水解成半乳糖和O-硝基酚（ONPE），ONPE在420 nm波長(zhǎng)處有特定的紫外吸收。通常情況下，ONPG透過細(xì)胞膜的速率很慢，但當(dāng)細(xì)胞膜的通透性改變時(shí)，大量的ONPG迅速透過細(xì)胞膜，導(dǎo)致420 nm處紫外強(qiáng)度的增加[25]。對(duì)照組的OD420nm為0.274，而試驗(yàn)組的OD420nm為0.683，增加的紫外強(qiáng)度說明了細(xì)胞膜通透性的提高。

A：對(duì)照組的PI熒光圖；B：試驗(yàn)組的PI熒光圖；C：電導(dǎo)率和β-半乳糖苷酶活性的變化

2.4 細(xì)胞膜的氧化損傷

2.4.1 ROS熒光照片和熒光強(qiáng)度 本試驗(yàn)中，非熒光探針DCFH-DA用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。DCFH-DA可以被ROS氧化成綠色熒光物質(zhì) 2',7'-二氯熒光素（DCF）。由圖6可以看出，經(jīng)過冷等離子體處理后，LM細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量綠色熒光，這些綠色熒光是DCFH-DA被ROS氧化后產(chǎn)生的，說明冷等離子體刺激LM產(chǎn)生了大量的ROS，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成巨大的氧化損傷。由圖6-D可以看出，對(duì)照組中的熒光強(qiáng)度在40 min內(nèi)幾乎沒有變化，而試驗(yàn)組中的熒光強(qiáng)度從0.45增長(zhǎng)到2.48（處理后20 min）和2.73（處理后40 min）。

2.4.2 ESR和qRT-PCR ESR儀可以檢測(cè)未成對(duì)的電子，因此，可以利用ESR技術(shù)鑒定LM細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS種類。由圖7-A可以看出，對(duì)照組的ESR譜圖里沒有任何明顯峰，說明對(duì)照組中沒有檢測(cè)到ROS的存在。試驗(yàn)組的ESR譜圖中檢測(cè)到6個(gè)明顯峰（用*標(biāo)記），這6重峰由烷基過氧化自由基、烷氧基自由基、烴基自由基和超氧自由基疊加造成[26]。

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)和表達(dá)量的變化，從基因?qū)用娼沂炯?xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生機(jī)制。和對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡具有重要影響。經(jīng)過冷等離子體處理后，和相對(duì)表達(dá)量下降明顯，分別比對(duì)照下降了43.29%和52.71%；而的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了89.42%（圖7-B）。說明冷等離子體通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)破壞了LM細(xì)菌內(nèi)的氧化還原平衡，進(jìn)而刺激了ROS的大量產(chǎn)生。

A：對(duì)照組ROS熒光圖片；B：CP處理20 min的熒光圖片；C：CP處理40 min的熒光圖片；D：ROS熒光強(qiáng)度

圖7 ESR譜圖（A）及perR、recA和sigB表達(dá)量（B）的變化

3 討論

細(xì)胞膜是保證細(xì)菌生存的重要屏障，對(duì)細(xì)菌的物質(zhì)交流和信息交換起著重要的作用。很多抗菌劑和殺菌裝置的設(shè)計(jì)都以細(xì)胞膜作為主要的作用位點(diǎn)。細(xì)胞膜的完整性對(duì)保護(hù)細(xì)菌的胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)和DNA等有重要意義。一旦細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生泄漏。OLATUNDE等[27]發(fā)現(xiàn)冷等離子體處理破壞了一些革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜，進(jìn)而加速了胞內(nèi)物質(zhì)如脂肪、蛋白質(zhì)和DNA的泄漏。本研究透射電鏡圖片顯示，經(jīng)冷等離子體處理后，LM細(xì)胞膜表面可觀察到明顯的破損結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的破損導(dǎo)致了蛋白質(zhì)和DNA的泄漏，使胞內(nèi)蛋白含量和DNA含量下降。

當(dāng)遭遇外部極端環(huán)境和抗菌處理時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞通常會(huì)主動(dòng)改變細(xì)胞膜中脂肪酸含量和類型，進(jìn)而改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性。不飽和脂肪酸有較低的熔融溫度，因此，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量越高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性就越大。脂肪酸的成分和含量分析結(jié)果證明，冷等離子體處理通過刺激不飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸含量的增加以及飽和脂肪酸含量的下降，間接增大了LM細(xì)胞膜的流動(dòng)性。然而ZHAO等[21]報(bào)道了不一樣的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞膜經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理后，不飽和脂肪酸含量從71.14%下降到60.56%，飽和脂肪酸含量從23.6%增長(zhǎng)到30.27%，說明脈沖電場(chǎng)降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。這種差異可能由菌種不同和處理方式不同引起，ANS熒光強(qiáng)度測(cè)定也證明了這個(gè)結(jié)果。冷等離子體處理后，熒光強(qiáng)度從8.99下降到3.73。細(xì)胞膜的流動(dòng)性越大，ANS就越不容易與細(xì)胞膜的疏水區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而熒光強(qiáng)度也就越低。細(xì)胞膜的流動(dòng)性對(duì)維持細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信息交流起到了至關(guān)重要的作用，流動(dòng)性的增大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的失衡，加速胞內(nèi)重要物質(zhì)的泄漏，影響細(xì)菌細(xì)胞的生理活性。細(xì)胞膜流動(dòng)性的增大提升了細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致膜不透性的熒光探針碘化丙啶可以自由地穿過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)結(jié)合并產(chǎn)生紅色熒光。此外，通透性的增加導(dǎo)致了電解質(zhì)和胞內(nèi)離子的泄漏，菌懸液的電導(dǎo)率也隨之提高。

細(xì)胞膜是胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的主要位點(diǎn)，主要通過氧化呼吸鏈在細(xì)胞膜上進(jìn)行積累。很多處理?xiàng)l件如紫外線處理、輻射等都會(huì)促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生超過自身承受極限的ROS，從而破壞氧化還原平衡，造成細(xì)胞膜的氧化損傷[28]。REN等[29]發(fā)現(xiàn)抗菌劑蝶芪處理會(huì)刺激大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，這些ROS的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激基因的上調(diào)有關(guān)。熒光圖片顯示，經(jīng)冷等離子體處理后，出現(xiàn)了大量的綠色熒光，這些綠色熒光由DCFH-DA經(jīng)ROS氧化后產(chǎn)生的2',7'-二氯熒光素（DCF）導(dǎo)致，熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)，說明冷等離子體處理刺激了細(xì)胞膜上ROS 的產(chǎn)生和積累，改變了細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性和通透性。ESR技術(shù)顯示這些自由基可能是烷基過氧化自由基、烷氧基自由基、烴基自由基和超氧自由基，這些自由基的共同作用給細(xì)胞膜造成巨大的氧化損傷。

和是LM細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原相關(guān)的基因，對(duì)維持LM的氧化還原平衡起著重要的作用。通過調(diào)節(jié)ROS敏感的轉(zhuǎn)錄抑制子的產(chǎn)生，從而解毒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性過氧化物和其他ROS[30]。而編碼的活化劑能夠催化細(xì)胞內(nèi)的SOS反應(yīng)，進(jìn)而可以清除ROS和修復(fù)ROS造成的損傷[31]。同時(shí)，也對(duì)ROS造成的氧化損傷起到一定的調(diào)節(jié)作用[32]。qRT-PCR結(jié)果顯示冷等離子體處理下調(diào)了和，上調(diào)了，說明ROS的產(chǎn)生與冷等離子體對(duì)這些氧化還原相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)，從基因?qū)用娼沂玖薘OS的產(chǎn)生機(jī)理。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用功率182 W，處理時(shí)間67 s，氮?dú)饬魉?2 cm3?min-1的冷等離子體最佳抑制條件研究其對(duì)LM細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性、通透性和氧化損傷的影響。經(jīng)冷等離子體處理后，細(xì)胞膜表面可以觀察到破損變形的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量和DNA含量下降，細(xì)胞膜完整性被破壞。同時(shí)，經(jīng)冷等離子體處理后，細(xì)胞膜磷脂不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量降低，ANS熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞膜流動(dòng)性增加。此外，冷等離子體增加了細(xì)胞膜的通透性，冷等離子體通過調(diào)節(jié)、和的相對(duì)表達(dá)量打破LM的氧化還原平衡，刺激了細(xì)胞膜上ROS的產(chǎn)生。

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Antibacterial Mechanism of Cold Plasma Against

DOU Yong1, YAO MiaoAi1, Lü HuaiZhong1, HU PeiHong2, DONG Jing1

(1Department of Grain Engineering and Food & Drug, Jiangsu Vocational College of Finance & Economics, Huai’an 223003, Jiangsu;2Huai’an Zhengchang Feed Co., Ltd, Huai’an 223003, Jiangsu)

【】As a novel non-thermal sterilization technology, the cold plasma has been widely applied in food industry. The aim of this study was to explore the antibacteral mechanism of cold plasma against bacteria at cytomembrane level, thus providing a foundation for the application of the cold plasma in food industry. 【】In this study, the(LM) was selected as the test strain. After cold plasma treatment, the changes of morphology and intracellular materials were detected to reveal the integrity of LM cytomembranes. The changes of cell membrane fatty acid content and type, as well as the 8-aniline-1-naphthalene sulfonic acid (ANS) fluorescence intensity were also measured to detect the fluidity change of cytomembranes after cold plasma treatment. The changes of cytomembrane permeabilization were detected by propidium iodide (PI) fluorescence, conductivity and-galactosidase activity. Finally, in order to demonstrate the oxidative damage of LM cytomembrane caused by cold plasma treatment, the changes of reactive oxygen species (ROS) and reactive oxygen species related genes were detected as well. 【】After cold plasma treatment, damaged and deformed structures were observed on the surface of the LM cytomembrane, the contents of proteins and DNA were decreased by 68 mg?mL-1and 14 μg?mL-1, respectively, which showed that cold plasma destroyed the integrity of cytomembrane. After cold plasma treatment, the content of unsaturated fatty acids in LM cytomembrane increased from 40.17% to 53.91%, along with the decrease of saturated fatty acids from 53.68% to 41.57%. The ANS fluorescence intensity decreased from 8.99 to 3.73, indicating the increase of cytomembrane fluidity caused by cold plasma action. In addition, cold plasma treatment resulted in the penetration of PI and reacted with DNA to emit red fluorescence. By analyzing the changes of-galactosidase activity and conductivity (increased from 0.15 mS?cm-1to 0.33 mS?cm-1), it was concluded that the cold plasma enhanced the permeabilization of LM cytomembrane. The changes of ROS fluorescence intensity indicated that cold plasma stimulated the generation of ROS on cytomembrane, thus exerting oxidative damage to cytomembrane. Finally, the results of qRT-PCR showed that cold plasma down-regulated the expression ofandgenes by 43.29% and 52.71%, while up-regulated the expression ofgene by 89.42%, which disclosed the regulatory mechanism of oxidative stress in microorganism at genic level.【】Through the action on cell membrane of the active groups of cold plasma, the viability of LM was inhibited and eventually died.

cold plasma;; cytomembrane; fluidity; oxidative damages

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.013

2020-04-17；

2020-06-10

江蘇省政策性引導(dǎo)項(xiàng)目--蘇北科技專項(xiàng)富民強(qiáng)縣項(xiàng)目（SZ-HA2019011）、2018年江蘇省“333”第五期人才資助項(xiàng)目、2016年江蘇省“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目（蘇教師（2016）15號(hào)）、江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院優(yōu)秀科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、2018年淮安市第二期“533英才工程”項(xiàng)目

作者及通信作者竇勇，E-mail：douyong1979@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）