唐江鋒 單麗紅 柳開(kāi)忠

（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院< 浙江省腫瘤醫(yī)院>< 中國(guó)科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所> 浙江 杭州 310022）

結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，早期不易發(fā)現(xiàn)，而多數(shù)中晚期患者仍死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。部分患者對(duì)化療藥物不敏感，且化療藥物不良反應(yīng)多。因此，充分發(fā)揮中醫(yī)中藥作用，積極尋找天然抗腫瘤中藥成分成為時(shí)下熱點(diǎn)。近年來(lái)對(duì)中藥丹參的研究逐漸增多， 丹參有效成分中的丹參酮Ⅱ A（Tanshinone Ⅱ A， Tan Ⅱ A）具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[1]，但有關(guān)丹參酮Ⅱ A 與結(jié)腸癌之間的機(jī)制研究尚不多。本文擬采用不同濃度的丹參酮Ⅱ A 體外干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，觀察其對(duì)Caco-2 細(xì)胞的作用，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1.材料與方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，Tan Ⅱ A 購(gòu)自中國(guó)藥物制品檢定所，胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，MTT 購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究，Trizol 試劑盒、RT-PCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人結(jié)腸癌Caco2 細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清，置于5% CO2濃度，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

β-actin（F：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’；R：5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’）

Smad4（F：5’-GAGAACTITGCCGTTGAAGC-3’；R：5’-CTCAATGTCAAGGGCCATCT-3'）

Smad2（F：5’-T T T G C G G A A T A A T C G T G T-3’；R：5’-AAGGTGCTTTAATTGATGAGAC-3’）

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2 細(xì)胞，用0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，制備成2×104/ml 細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔加入200mL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h 后，將其分為 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別加入不同濃度TanⅡ A培養(yǎng)液，使其終濃度為0.3、0.6、1.2、2.4mg/L，另設(shè)不加細(xì)胞只加等量培養(yǎng)液的對(duì)照組。分別作用24h、48h、72h 后，每孔加入新鮮配置的5g/L MTT 溶液20μL，繼續(xù)37℃孵育4h 后棄上清，再加入150μL DMSO，震蕩10min 后，使用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。

1.2.4 RT-PCR

分別收集對(duì)照組、Tan Ⅱ A 1.2mg/L 組，Tan Ⅱ A 2.4mg/L組處理72 小時(shí)后的Caco-2 細(xì)胞，按Trizol 試劑盒說(shuō)明方法提取細(xì)胞總RNA，再根據(jù)One Step RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照25 μl 體系，以β-actin 為內(nèi)參照進(jìn)行操作。最后觀測(cè)擴(kuò)增曲線及溶解曲線，根據(jù)2-ΔΔct分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較采用方差分析， P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 MTT 法測(cè)定Tan Ⅱ A 對(duì)Caco-2 增殖抑制率的影響

不同濃度的Tan Ⅱ A 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響，見(jiàn)表1。不同藥物濃度組與對(duì)照組之間的細(xì)胞增殖抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05），同一藥物濃度組以72 小時(shí)抑制率最高。而同樣作用72 小時(shí)，以2.4mg/L 組抑制率最高，見(jiàn)表1。

表1 Tan II A 對(duì)Caco-2 增殖抑制率的影響

2.2 Tan Ⅱ A 對(duì)Caco-2 Smad4 和Smad2 mRNA 表達(dá)的影響

利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)情況，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，Tan Ⅱ A 1.2mg/L 和2.4mg/L 實(shí)驗(yàn)組Smad4、Smad2 mRNA 表達(dá)明顯增多（P ＜0.01）。

圖1 TanII A 干預(yù)Caco-2 細(xì)胞72 小時(shí)后Smad4 mRNA、Smad2 mRNA 的RT-PCR結(jié)果

3.討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，早期癥狀不明顯，許多病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，即使是結(jié)腸癌早期患者接受了根治性手術(shù)及輔助治療，也仍有約半數(shù)術(shù)后患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。

Smad 蛋白家族是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）家族的重要下游信號(hào)分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Smad 蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同分為受體激活型Smads、共同介導(dǎo)型Smads 及抑制型Smads。Smad2 屬于受體激活型Smad 蛋白，可被TGF-β的I 型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體磷酸化，隨后與共同介導(dǎo)型的Smad4 蛋白形成異源性多聚體，并進(jìn)入核內(nèi)與DNA 特異性短序列SBE-Smads 結(jié)合，激活DNA 轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)[3]。其中Smad4 基因位于人染色體18q21，是首先在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其所編碼的Smad4 蛋白是TGF-β/Smad 信號(hào)通路的中心分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，所有生物學(xué)效應(yīng)都是不同類型Smads 蛋白與Smad4 相互作用的結(jié)果[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)約1/3的結(jié)腸癌患者存在Smad4缺失或突變，而結(jié)腸癌患者中也常有Smad2 基因的失活，而這種突變、缺失和失活與結(jié)腸癌的惡化及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且Smad2、Smad4 蛋白低表達(dá)的結(jié)腸癌患者往往不良預(yù)后[6]。

丹參酮Ⅱ A 是從中藥丹參中提取的脂溶性有效成分，其不僅具有抗炎，抗氧化和抗纖維化的作用，還具有抗腫瘤的作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用，并可通過(guò)細(xì)胞毒作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 能抑制結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞增殖，同一藥物濃度組作用24、48、72 小時(shí)后，以72 小時(shí)抑制率最高。進(jìn)一步的PCR分析發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A 實(shí)驗(yàn)組Smad2、Smad4 mRNA 表達(dá)較對(duì)照組顯著升高。這些結(jié)果提示丹參酮Ⅱ A 能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2增殖生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Smad2、Smad4 表達(dá)進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的目的。

綜上所述，丹參酮Ⅱ A 能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2 的增殖，其機(jī)制可能與丹參酮Ⅱ A 上調(diào)Smad2、Smad4 表達(dá)有關(guān)，為中醫(yī)中藥治療結(jié)腸癌提供新思路。