孫鴻妍，楊 梅，張曉天，任浩文，劉秀敏，朱洪權(quán)

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130041)

乳腺癌是一種臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著我國女性生命健康[1]。在乳腺癌患者中，有很多患者由于病灶轉(zhuǎn)移至其他臟器而引發(fā)死亡。據(jù)資料顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移十分迅速，在早期檢查時(shí)就發(fā)生轉(zhuǎn)移者可達(dá)10%，而僅有20%的患者在確診乳腺癌后可生存5年以上[2]。因此，危及乳腺癌患者生命的關(guān)鍵在于乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。對(duì)于以往乳腺癌的診斷，常采用影像學(xué)方法來檢查乳腺癌原發(fā)病灶。然而，該方法只有病灶腫物直徑大于5 mm時(shí)才可被捕捉到，故無法及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤是否轉(zhuǎn)移[3]。因此，對(duì)于乳腺癌轉(zhuǎn)移和診斷的研究，尋找一種可盡早發(fā)現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移情況的檢測指標(biāo)成為了現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。而通過液體活檢所得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，其操作微創(chuàng)性及可實(shí)時(shí)監(jiān)測性等優(yōu)點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)乳腺癌的早期診斷和監(jiān)測轉(zhuǎn)移[4]。

1 CTC的生物學(xué)特性

CTC是指來源于原發(fā)瘤體，在某些理化因素作用下不受血流切割力及機(jī)體免疫效應(yīng)等影響脫離基底膜而進(jìn)入血液的腫瘤細(xì)胞[5]。由于來自原發(fā)瘤體，其與原發(fā)腫瘤細(xì)胞性質(zhì)相同，因此可通過對(duì)CTC的檢測來判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。腫瘤細(xì)胞脫離基底膜后進(jìn)入血液，在血流切割損傷、免疫殺傷以及細(xì)胞凋亡等作用下，最終在外周血所有細(xì)胞中，有活性的CTC僅占<0.01%，稱為高轉(zhuǎn)移潛能CTC[6]。更有研究表明，CTC在外周血中含量甚微，檢測106-107個(gè)白細(xì)胞才能捕捉到一個(gè)CTC。這表明CTC數(shù)量具有稀有性[7]。同時(shí)，CTC具有較強(qiáng)的異質(zhì)性。為了加速腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程，部分CTC會(huì)有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生，即上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型，導(dǎo)致上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[8-9]。不同腫瘤以及不同TNM分期的腫瘤其細(xì)胞表型會(huì)有所不同，因此，檢測腫瘤患者的CTC在癌癥的精確診斷中發(fā)揮了重要作用。

2 CTC的轉(zhuǎn)移機(jī)制

從原發(fā)病灶脫落的腫瘤細(xì)胞躲避了多種殺傷因素而存活下來，進(jìn)一步浸潤血管內(nèi)皮進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)并參與循環(huán)，植入靶器官并增殖，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。這就是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的“種子-土壤”學(xué)說。Giovanni Zarrilli等[11]認(rèn)為，種子是由腫瘤細(xì)胞、其他細(xì)胞和基質(zhì)組成的復(fù)合物。其中的內(nèi)皮細(xì)胞受腫瘤細(xì)胞刺激后產(chǎn)生新的細(xì)小血管為腫瘤增殖提供能量及動(dòng)力；巨噬細(xì)胞產(chǎn)生可溶解因子以促進(jìn)其生長及遷移。土壤則是靶器官的基底膜，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供合適的環(huán)境。同時(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通過促進(jìn)CTC的生成及遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。CTC發(fā)生EMT時(shí)上皮連接蛋白表達(dá)減少，間質(zhì)黏附蛋白表達(dá)增加，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮蔚拈g質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上有利于腫瘤細(xì)胞的遷移[12]。EMT可提高CTC在外周血中的存活能力，增加了CTC的移行性，進(jìn)而增加了CTC的侵襲性[13]。CTC不斷生成及遷移，進(jìn)而侵襲組織，完成了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。

3 CTC檢測在乳腺癌診斷及治療中的應(yīng)用

3.1 乳腺癌的早期篩查及診斷

由于液體活檢的創(chuàng)傷較小、操作簡單、樣本較容易獲取，且CTC的檢測僅需采集受檢者的外周血，故可通過CTC檢測來對(duì)乳腺癌進(jìn)行早期篩查。Cristofanilli等[14]認(rèn)為，通過檢測外周血中是否存在CTC以及在一段時(shí)間后CTC數(shù)是否有增加趨勢，可以較早篩查出乳腺癌患者，早期即可采用適宜的方案進(jìn)行治療。Kallergi G等[15]對(duì)25例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTC中間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin及Twist 1進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均為陽性，故可利用CTC對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行診斷。Lang JE等[16]認(rèn)為，目前，我們通過檢測CTC的RNA序列，來對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷是可行的。該方法通過對(duì)乳腺癌患者的CTC進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，并與乳腺癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)乳腺癌類型的診斷。Gradilone A等[17]對(duì)92例乳腺癌患者的CTC進(jìn)行檢測，其中有91%的Ⅳ期患者CTC具有ALDH1(+)，波形蛋白(+)，纖維蛋白(+)的特征。并且，ALDH1(+)與疾病分期顯著相關(guān)。因此，CTC可對(duì)不同分期的乳腺癌患者進(jìn)行診斷。對(duì)于乳腺癌的診斷，由于免疫殺傷等作用的影響，CTC在血液中含量過少，因此，仍需以組織活檢及影像學(xué)檢查為基礎(chǔ)，將CTC檢測作為輔助檢查手段，更早地發(fā)現(xiàn)乳腺癌的存在。

3.2 預(yù)測乳腺癌的轉(zhuǎn)移情況

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落進(jìn)入到外周血中形成CTC，具有與原發(fā)腫瘤相似的生物學(xué)特性，故可通過對(duì)血液中CTC的檢測來反映乳腺癌原發(fā)病灶的狀態(tài)。因此，CTC可作為乳腺癌患者轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警。CTC對(duì)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的預(yù)測能力與CTC的數(shù)量成正比[18]。CTC的檢測可用于評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。據(jù)文獻(xiàn)顯示，Ning Xie等[19]選取了38例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，同時(shí)在健康女性中隨機(jī)抽取25位作為對(duì)照組，通過免疫熒光法檢測CTC。結(jié)果表明，有73.3%的患者血液中至少含有1個(gè)CTC，而對(duì)照組無CTC檢出。按轉(zhuǎn)移部位數(shù)量分為三組，1個(gè)、2個(gè)及3個(gè)以上的CTC陽性率分別為33%、50%及95.45%。且患者CTC陽性率越高，患者的總生存率(OS)越短。經(jīng)多變量分析可知，患者OS與CTC及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，呈顯著相關(guān)。此外，CTC檢測是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者有效的預(yù)后工具。Huebner等[20]進(jìn)行了一項(xiàng)CTC檢測與其預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后能力的研究。在該研究中，血液中≥1個(gè)CTC的患者的OS低于未檢測出CTC的患者。且當(dāng)患者出現(xiàn)每7.5 ml血液中≥5個(gè)CTC時(shí)，患者的無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和OS均出現(xiàn)顯著縮短。由此可見，CTC是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵預(yù)測因子。因此,利用液體活檢的方式對(duì)外周血中的CTC進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌患者轉(zhuǎn)移情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。

3.3 動(dòng)態(tài)監(jiān)測乳腺癌進(jìn)展及選擇治療方案

在已確診的乳腺癌患者中，對(duì)其外周血中CTC進(jìn)行檢測，來判斷原發(fā)病灶的異質(zhì)性，通過異質(zhì)性來動(dòng)態(tài)監(jiān)測癌癥進(jìn)展情況。Vasseur A等[21]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，選取254名乳腺癌患者利用AdnaTest和CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行CTC檢測。得到的結(jié)果分別為：有42%的HER2+患者中只含有HER2-的CTC，有33%的HER2-患者中含有HER2+的CTC。這反映了乳腺癌在疾病發(fā)展過程中出現(xiàn)了異質(zhì)性，腫瘤的耐藥性也會(huì)隨之增加。隨時(shí)對(duì)患者的CTC進(jìn)行檢測，通過CTC陽性率的變化，可盡早發(fā)現(xiàn)對(duì)一線治療產(chǎn)生耐藥性的情況。這一變化，可指導(dǎo)醫(yī)生盡早改變治療藥物，在惡化、轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行干預(yù)。這種方法發(fā)現(xiàn)病人耐藥性可早于臨床表現(xiàn)或影像學(xué)約2個(gè)月[22]。此外，通過CTC的計(jì)數(shù)，可以用來選擇乳腺癌患者適宜的治療方案。通過STIC-CTC試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CTC<5個(gè)/7.5 ml時(shí)，采用內(nèi)分泌治療，當(dāng)CTC≥5個(gè)/7.5 ml時(shí)，進(jìn)行化學(xué)治療的治療方案，使乳腺癌患者的PFS得以顯著升高[23]。因此，分析外周血中的CTC可判斷腫瘤的發(fā)展情況，并有助于進(jìn)行更有效的治療選擇。

3.4 判斷藥物的治療療效

通過CTC的檢測，可為患者確定最有效的治療方法。治療過程中，根據(jù)患者CTC的變化情況可判斷患者的預(yù)后，從而判斷治療藥物療效。Magbanua MJM等[24]最近的一項(xiàng)研究表明，采用治療前后CTC變化趨勢曲線與單純CTC計(jì)數(shù)相比可以更全面地判斷藥物療效，也能更好地預(yù)測乳腺癌患者的OS及PFS。通過對(duì)CTC的檢測，可以判斷腫瘤存在的異質(zhì)性，這可為HER2-乳腺癌但HER2+的CTC患者使用抗HER2藥物療效不足提供依據(jù)，從而及時(shí)尋找新的治療藥物[25]。目前有研究表明，利用CTC計(jì)數(shù)可知，外周血中CTC<5個(gè)/7.5 ml的患者早先采取新療法要比CTC≥5個(gè)/7.5 ml的患者療效好[26]。因此，CTC的檢測對(duì)于判斷治療乳腺癌藥物的療效，具有一定的幫助。

3.5 發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)

由于外周血的采集較為方便，因此，可隨時(shí)、多次對(duì)外周血中CTC進(jìn)行檢測，這種液體活檢技術(shù)可使醫(yī)生隨時(shí)掌握乳腺癌患者的病情變化。由于腫瘤具有異質(zhì)性，通過液體活檢可檢測到在轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生的生化變化，而這在原發(fā)腫瘤中是不存在的，有助于尋找適宜的、有針對(duì)性的治療靶點(diǎn)[27]。此外，不同患者的CTC表型存在差異，對(duì)CTC的分子表型進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，從而指導(dǎo)臨床上更好地進(jìn)行個(gè)體化治療，有助于進(jìn)入“精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代”[28]?？蓪?duì)乳腺癌患者的CTC進(jìn)行RT-PCR檢測，判斷腫瘤細(xì)胞基因是否發(fā)生突變。若發(fā)生突變可能表明耐藥性增強(qiáng)，提示需要尋找新的治療靶點(diǎn)[29]。但該方法局限于CTC計(jì)數(shù)較高的患者。就目前CTC的生物學(xué)分選方法來說，捕獲CTC的標(biāo)志物常采用上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)。但由于EpCAM在發(fā)生EMT的過程中可能發(fā)生下調(diào)，因此，目前需尋找更多的間質(zhì)標(biāo)志物來捕獲CTC，完成對(duì)CTC的富集[30]。根據(jù)對(duì)CTC的檢測，可以判斷腫瘤細(xì)胞mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，而許多蛋白質(zhì)是抗腫瘤藥物的實(shí)際靶點(diǎn)，這對(duì)確定乳腺癌的治療十分有利[31]。

4 小結(jié)

CTC檢測作為乳腺癌檢查的輔助手段，由于其可實(shí)時(shí)監(jiān)測乳腺癌的進(jìn)展、識(shí)別腫瘤異質(zhì)性且創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為了一項(xiàng)臨床感興趣的液體活檢技術(shù)。CTC可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，目前，研究人員已成功建立乳腺癌患者的CTC細(xì)胞系及CTC異種移植物，可將二者用于體內(nèi)及體外藥敏試驗(yàn)，從而判斷腫瘤細(xì)胞耐藥性及增加新的治療靶點(diǎn)。目前來看，部分實(shí)驗(yàn)對(duì)CTC數(shù)量具有一定的要求，但CTC檢測的靈敏度及特異性較低，低檢出率往往限制了CTC檢測的臨床應(yīng)用，未來應(yīng)尋找新的分離及檢測技術(shù)，更好地將CTC應(yīng)用于臨床。目前新興的液體活檢技術(shù)，也包括ctDNA的檢測。ctDNA可提供腫瘤的基因組信息，其比CTC更易分離，且具有較高的特異性及靈敏度。但有些信息是無法從ctDNA中獲得的，例如CTC可提供從蛋白質(zhì)和RNA中獲得的信息。故在組織活檢及影像學(xué)基礎(chǔ)上，可將CTC與ctDNA結(jié)合，對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行更加全面，多方位檢測。發(fā)揮液體活檢技術(shù)更大的潛力，使患者及時(shí)得以更有針對(duì)性的治療。