劉思妤 劉嫣 歐陽杰

【摘要】目的 探討二氫楊梅素（DHM）對體外棕櫚酸（PA）誘導人臍靜脈內皮細胞衰老的抑制作用及其與HMGB1/TLR-4通路的關系。 方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞株（ HUVECs） ，觀察不同濃度二氫楊梅素干預PA處理的HUVECs 衰老的變化。檢測細胞衰老、測定細胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β的含量、檢測TLR-4 的蛋白表達。 結果 PA處理內皮細胞 48h 能引起細胞β-半乳糖苷酶染色細胞增加，細胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β蛋白含量顯著升高，細胞中 HMGB1及TLR-4蛋白表達上調。與PA組比較，可以增加細胞活性; 降低細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率、TLR-4蛋白的表達、細胞中IL-6及IL-1β釋放顯著減少，呈濃度依賴性。 結論 DHM對體外PA誘導的HUVECs 衰老有抑制作用，其作用機制與減少HMGB1釋放、下調TLR-4蛋白表達，從而減少炎癥釋放有關。

【關鍵詞】二氫楊梅素;HMGB1;TLR-4;HUVECs;棕櫚酸

基金項目：湖南省自然科學基金青年項目（2018JJ3480）;湖南省教育廳科學研究優(yōu)秀青年項目（18B498）;湖南省衛(wèi)生健康委科研課題（202102040901）;湖南省普通高校青年骨干教師培養(yǎng)經費（湘教通[2018]574號）;湖南省雙一流應用特色學科藥學學科項目（湘教通[2018]469號）資助。

糖尿病是一種以葡萄糖和游離脂肪酸水平升高為特征的代謝性疾病，其嚴重的心血管并發(fā)癥已成為威脅人類健康的主要因素。越來越多的證據表明，血管內皮細胞長期暴露在高脂血癥的環(huán)境中，會導致內皮提前衰老，并促進血管炎癥和動脈粥樣硬化，從而導致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。炎癥的過量產生在細胞衰老中起著重要作用。高遷移率族蛋白-1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白，在高脂環(huán)境下HMGB1從細胞核中釋放，通過與晚期糖基化產物受體（RAGE）和Toll樣受體4（TLR4）結合，進一步觸發(fā)炎癥通路，發(fā)揮促炎作用。二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHM）是藤茶中的主要黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、調血脂及降血糖等多種藥理活性。有證據表明DHM對心血管有保護作用，但DHM對糖尿病血脂異常狀態(tài)下引起的血管病變可能的有益作用尚未完全闡明。在本研究中，我們試圖證明DHM對棕櫚酸（PA）誘導的血管內皮細胞衰老和可能機制的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（American Type Culture Collection，ATCC）;DHM、PA（Sigma公司）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和含EDTA胰蛋白酶（HyClone公司）;HMGB1、IL-6、IL-1βELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司）;BCA蛋白質濃度測定試劑盒、β-半乳糖苷酶檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）;TLR4和β-actin一抗（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HUVECs在含有10 %的FBS及1 %青霉素/鏈霉素的內皮細胞培養(yǎng)基（DMEM）并于37 ℃，5 % CO2濕潤的環(huán)境下培養(yǎng)。待單層細胞貼壁達 85% 左右時，可進行傳代或后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組

用DHM （ 0.1、1、10 μmol/L ） 預處理細胞1 h后，再加PA（0.3 mmol/L）干預48h。實驗分為：正常對照組、PA處理組、溶劑組、二氫楊梅素（0.1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（10μmol/L） +PA處理組。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色方法及陽性細胞計數

按廠家說明書對細胞進行 β-半乳糖苷酶染色，于普通光學顯微鏡下觀察人工計數分析統(tǒng)計藍綠色的-半乳糖苷酶陽性細胞，結果以陽性細胞數/總細胞數100%表示。

1.2.4 酶聯免疫法測定IL-6、IL-1β的含量

按廠家說明書，用人HMGB1、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒測定不同處理后細胞上清夜中HMGB1、IL-6、IL-1β的水平。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達

所提細胞總蛋白經SDS-PAGE 分離后以β-actin 為內參照，兔抗羊TLR4 為一抗，通過Western blotting 法測定其TLR4 相對表達量，實驗重復3 次。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

數據用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行處理，組間差異顯著性采用單因素方差分析（ One-Way ANOVA） 進行統(tǒng)計學分析，組間的兩兩比較采用LSD法，P< 0.05 認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 DHM對PA誘導內皮細胞衰老SA-β-gal活性的比較

與正常對照組比較，0. 3 mmol/L PA組SA-β-gal 陽性細胞率明顯升高（P < 0.01）。與PA組比較，內皮細胞SA-β-gal 陽性細胞率隨著DHM藥物濃度的逐漸提高顯著降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖1）。

2.2 DHM 對PA誘導內皮細胞 HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白釋放的影響

與正常對照組比較，PA組細胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量明顯增加 （P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度DHM 組內皮細胞細胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量呈劑量依賴性降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖2）。

2.3 DHM 對PA誘導內皮細胞TLR4 蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較，PA組TLR4蛋白表達明顯增加（P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度 DHM組內皮細胞TLR4 蛋白表達呈劑量依賴性降低P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖3）。

3 討論

本研究首次證明DHM可通過下調HMGB1及TLR4蛋白表達抑制炎癥釋放，從而減輕PA誘導的HUVECs衰老。內皮細胞衰老是動脈粥樣硬化的起始階段，研究表明，炎癥是誘導衰老的重要因素，而脂毒性刺激可以促進血管內皮細胞衰老。在這項研究中，我們用PA處理HUVECs，模擬糖尿病的血脂代謝病理應激狀態(tài)，也證實了PA能誘導HUVECs衰老。

血脂異常是動脈粥樣硬化的主要危險因素。PA可通過與TLR4輔助蛋白髓樣分化蛋白2直接相互作用促進血管損傷的發(fā)展。HMGB1是一種必要且充分的炎癥介質。當血管損傷時，它可以通過TLR4發(fā)出信號，最終導致NF-κB的激活，誘導促炎細胞因子的產生，從而促進炎癥。本研究發(fā)現PA損傷的血管內皮細胞中HMGB1釋放、TLR4的表達水平均高于正常對照組，同時炎性因子IL-6及及IL-1β 釋放增加。提示PA誘導的HUVECs衰老與HMGB1釋放、TLR4表達升高釋放炎性因子有相關性。

以往研究表明，DHM對血管內皮細胞炎癥損傷有保護作用[7]。我們的研究證明，DHM能有效降低PA誘導的內皮細胞β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率，抑制細胞衰老。與此同時，DHM能顯著降低細胞上清液中炎癥因子IL-6及IL-1β的含量，減少HMGB1釋放及下調TNF4蛋白的表達。這提示二氫楊梅素改善PA誘導的HUVECs細胞衰老可能與HMGB1/TLR4信號途徑有關。

綜上所述，HMGB1的表達及釋放增加與PA誘導HUVECs衰老有密切關系。二氫楊梅素可以通過減少HMGB1的表達抑制TLR4蛋白表達，從而抑制炎癥的發(fā)生改善PA誘導的HUVECs的損傷，對降低糖尿病血脂紊亂引起的血管病變發(fā)生的風險具有潛在的應用價值。

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第一作者簡介：劉思妤（1981-），女，湖南郴州，碩士，副教授，主要從事中藥藥理學研究。