伊海金

耳科學是以研究聽覺與平衡系的重要學科，其常見疾病為耳聾與眩暈，我國目前有耳聾患者2 700萬人，其中聾啞人200多萬，并以每年3萬多的數(shù)量在增長；眩暈更是臨床常見的癥狀，眩暈的患病率為0.5%,約占內(nèi)科門診的5%、耳鼻咽喉科門診15%，70歲以上的男性及女性老人眩暈的發(fā)病率分別達47%和61%。耳聾及眩暈給個人、家庭及社會帶來巨大的痛苦和沉重負擔，加強耳科學的基礎(chǔ)與臨床研究，尤其是拓展耳聾及眩暈基礎(chǔ)研究，創(chuàng)新耳聾與眩暈的治療技術(shù)是解決上述問題的關(guān)鍵所在。醫(yī)學創(chuàng)新研究往往需要動物實驗驗證,動物模型在生物醫(yī)學研究中占有重要地位。因此，尋找合適的動物模型至關(guān)重要。

動物模型指用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的實驗動物，以進行相關(guān)疾病及其他科學問題研究，目前嚙齒類動物應(yīng)用最為廣泛。嚙齒類動物模型存在的主要問題是與人親緣關(guān)系較遠，其遺傳、體型以及壽命與人類存在較大差異[1]，限制了在人類疾病、藥物開發(fā)以及治療方面的應(yīng)用。非人類靈長類動物與人類親緣關(guān)系近，但存在倫理問題，并且應(yīng)用費用昂貴、技術(shù)復雜、資源匱乏[1]。大量研究表明，豬與人的氨基酸同源性達84.1%，在解剖結(jié)果、生理代謝以及疾病發(fā)生機理上與人有很多相似之處[2]，目前在動物實驗領(lǐng)域應(yīng)用日趨廣泛。

1 豬及小型豬動物模型在醫(yī)學及耳科學領(lǐng)域的應(yīng)用概述

以豬作為人類疾病動物模型的研究目前主要包括循環(huán)系統(tǒng)疾病、器官移植、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、皮膚病、遺傳性疾病及腫瘤等領(lǐng)域，對于開展醫(yī)學基礎(chǔ)研究及創(chuàng)新臨床新技術(shù)應(yīng)用發(fā)揮重要作用[3-4]。尤其是自1949年明尼蘇達州小型豬在Hormel研究所應(yīng)用以來[5]，因其體型較小，操作方便，具有與人類在基因、解剖和生理上的相似性以及經(jīng)濟學、倫理學方面的優(yōu)勢，小型豬作為大型動物模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學研究領(lǐng)域[6]。

在耳科學領(lǐng)域，新西蘭兔、豚鼠、沙鼠等小型哺乳動物都是傳統(tǒng)的耳科實驗動物模型[7-10]，其中常用動物模型是嚙齒類動物，因其體型及內(nèi)耳體積較小，發(fā)育成熟晚，解剖結(jié)構(gòu)與人類差異較大，阻礙了此類動物模型在耳科領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。由于豬與人類存在諸多相似性，諸多學者開始初步探索豬在耳科動物實驗中的應(yīng)用。Ikarashi等[11-12]以豬為模型進行了中耳炎與乳突氣化之間相關(guān)性研究，也有部分學者應(yīng)用豬模擬人類中耳手術(shù)進行中耳手術(shù)教學訓練[13-14]。此外，還有學者對豬聽覺功能的初步研究，Hansen等人[15]在1992年研究高膽紅素血癥對新生仔豬聽覺誘發(fā)電位的影響，在實驗過程中清晰的記錄到新生豬仔聽覺腦干反應(yīng)。與在其他醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應(yīng)用相比，豬在耳科動物實驗領(lǐng)域的應(yīng)用并沒有形成體系，而且應(yīng)用對象僅限于家豬，在世界范圍內(nèi)沒有應(yīng)用小型豬耳科動物模型的報道。

2 小型豬耳科動物模型在中國的建立及應(yīng)用

國內(nèi)關(guān)于小型豬在耳科領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用主要集中在中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科楊仕明、郭維維團隊，該團隊通過創(chuàng)新研究，在國際上率先提出并證明了小型豬是耳科疾病研究最為理想的實驗動物，并系統(tǒng)應(yīng)用小型豬開展耳聾及眩暈發(fā)病機制、新型治療技術(shù)實驗研究，為耳聾及眩暈基礎(chǔ)研究開創(chuàng)新領(lǐng)域。

2.1 小型豬耳部形態(tài)學、發(fā)育學、聽力學和前庭功能及電生理研究為小型豬耳科動物模型建立奠定基礎(chǔ)

2.1.1 小型豬顳骨及耳部顯微解剖 通過對小型豬顳骨及耳部進行顯微解剖研究，目前已證實小型豬顳骨結(jié)構(gòu)中的中耳、內(nèi)耳、面聽神經(jīng)及外側(cè)隱窩和人類耳部具有高度相似性。通過對小型豬的外耳、中耳、內(nèi)耳及外側(cè)隱窩的形態(tài)觀察和數(shù)據(jù)測量發(fā)現(xiàn)[16-17]：小型豬的中耳包括鼓室6壁，其上壁、外壁、內(nèi)壁、前壁與人類似，下壁為乳突，后壁為半規(guī)管，與人類不同，鼓室內(nèi)聽骨、面神經(jīng)及其分支的位置、毗鄰均類似人類；小型豬耳蝸為3轉(zhuǎn)半，除此不同之處以外，其耳蝸、前庭及半規(guī)管的形態(tài)、位置均與人類相似；小型豬的腦干耳蝸核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及毗鄰，包括外側(cè)隱窩、脈絡(luò)叢及聽面束等神經(jīng)的形態(tài)、位置及毗鄰與人類類似，其Luschka孔位于絨球、二腹葉和舌咽神經(jīng)根部圍成的三角形內(nèi)[16-17]。另外，侯昭暉等[18]通過對小型豬咽鼓管的研究也證實小型豬是咽鼓管研究的理想動物模型。

2.1.2 小型豬內(nèi)耳形態(tài)及發(fā)育豬耳蝸感覺上皮的分化首先從底圈開始，再到蝸管中部，然后逐漸向頂圈進行，這與人類耳蝸發(fā)育及功能的建立具有相似性[19]。通過形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)：耳蝸螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)的結(jié)構(gòu)與人類相似，豬的螺旋器包含毛細胞、柱細胞、Deiters'細胞、Hensen's細胞、B?ttcher細胞（人類除外）和內(nèi)外溝細胞。另外，豬耳蝸具有與人類相似的4排毛細胞的排列方式，不同之處在于頂回毛細胞的靜纖毛呈束狀排列且較長；其前庭毛細胞呈樹枝狀排列，并且有耳石覆蓋[20]。以上研究證實，小型豬內(nèi)耳的發(fā)育與形態(tài)學與人類極其類似。

2.1.3 小型豬聽覺與前庭電生理在對小型豬形態(tài)學研究的基礎(chǔ)之上，通過研究小型豬聽閾及敏感聽力范圍發(fā)現(xiàn)：小型豬與人類聽性腦干電位的特性比較發(fā)現(xiàn)豬都可以分化出7個波，但豬以Ⅱ波和Ⅴ波最顯著，人以Ⅴ波最顯著，其ABR波形、潛伏期與人極為相似[21-22]，嚙齒類的動物只能分化出Ⅰ～Ⅴ波，說明在整個聽覺傳導通路上，豬與人有相似的神經(jīng)核團，而鼠有所缺失。同時對小型豬的耳蝸內(nèi)電位進行測試，為今后以小型豬為模型進行耳科疾病的外科治療實驗及電生理測試奠定基礎(chǔ)。另外對前庭系統(tǒng)也進行系統(tǒng)研究[23-24]，探索小型豬肌源性誘發(fā)前庭電位的最佳檢測方法，并得出結(jié)論，小型豬頸部伸肌和咬肌在強聲下誘發(fā)的肌源性電位潛伏期和閾值均一致，其咬肌位置表淺，便于定位，更易于肌源性誘發(fā)電位的記錄。以上研究為通過小型豬開展前庭疾病研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 以小型豬為動物模型開展各種耳聾模型及耳聾機制研究通過小型豬形態(tài)及內(nèi)耳研究，成功構(gòu)建了新型耳科動物模型，以此動物模型為基礎(chǔ)，進一步構(gòu)建不同類型耳聾模型并進行耳聾與眩暈的基礎(chǔ)研究。如通過噪聲暴露方法、乙基亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）化學誘變方法和基因編輯技術(shù)構(gòu)建了小型豬噪聲性聾、Mondini畸形、單側(cè)聾、MITF基因突變、大前庭水管綜合征等一系列小型豬模型，為研究噪聲性耳聾及遺傳性耳聾發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)[25]。

2.2.1 噪音性聾應(yīng)用脈沖式火花噪聲儀對正常小型豬進行噪聲暴露，首次成功的建立了小型豬噪聲性聾動物模型，分析噪聲性聾小型豬聽功能及內(nèi)耳形態(tài)的特點，填補了大型哺乳動物噪聲性聾動物模型的空白。在此基礎(chǔ)之上，嘗試應(yīng)用mPEG-PLGABSA-FITC-NPs納米顆粒進行小型豬噪聲性聾動物模型的內(nèi)耳導入研究，為未來大型哺乳動物聽功能干預研究提供重要的研究基礎(chǔ)[26]。

2.2.2 遺傳性聾在小型豬耳科動物模型的建立與應(yīng)用過程中，科研團隊定位、克隆出一種自發(fā)性先天性耳聾豬模型的致病基因，其臨床表現(xiàn)與人類Waardenburg綜合征2A型的特點類似[20]，通過研究證實其發(fā)病機制可能是由于MITF-M型基因突變,其內(nèi)耳血管紋中間細胞缺失、毛細胞缺失、蝸管發(fā)育異常、螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量減少，導致其耳蝸內(nèi)電位異常、聽性腦干反應(yīng)電位不能引出，為研究該病的機制和治療提供了天然的模型[27-28]，對于研究干細胞移植等耳聾治療措施的途徑和方法也具有很大的幫助[29]。另外，通過ENU化學誘變小型豬的方法獲得白色耳聾突變小型豬，并建立家系，對該家系的表型、聽力及內(nèi)耳形態(tài)學等方面進行評估，首次發(fā)現(xiàn)Mondini畸形小型豬模型及家系，為Mondini畸形的進一步研究提供了寶貴的動物模型。小型豬動物模型將為人遺傳性聾的致病機理研究、臨床治療及藥物篩選等提供重要的生物工具[29]。

2.2.3 聽神經(jīng)病通過實驗研究發(fā)現(xiàn)ouabain溶液對小型豬螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有損傷，可導致聽閾明顯提高，且損傷程度具有濃度依賴性，但ouabain對毛細胞的影響不明顯，此研究結(jié)果有助于通過使用ouabain溶液建立小型豬的聽神經(jīng)病動物模型。后續(xù)實驗會進一步研究應(yīng)用ouabain溶液時畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions，DPOAE)、耳蝸微音器電位（cochlearmicrophonics，CM）及內(nèi)耳形態(tài)學等指標的變化，有望成功的建立人類聽神經(jīng)病的小型豬動物模型[30]。

2.3 以小型豬為動物模型開展人工聽覺植入研究

2.3.1 人工耳蝸植入動物實驗是驗證新型人工耳蝸的必要步驟，小型豬耳蝸與人類類似，可以直接應(yīng)用人類耳蝸電極進行植入實驗，是非常合適的人工耳蝸實驗動物模型[31-32]。傳統(tǒng)耳蝸動物模型包括貓、豚鼠等，產(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)不能完全反映人類用電極真實情況。通過用小型豬模型進行電子耳蝸植入研究，將國產(chǎn)電子耳蝸樣機植入小型豬耳內(nèi)，檢驗產(chǎn)品的安全性、有效性和穩(wěn)定性，為臨床患者的實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時初步獲得了耳聾豬的聽力恢復數(shù)據(jù)[33]，為建立人工耳蝸大型哺乳動物實驗植入平臺奠定基礎(chǔ)。

2.3.2 聽覺腦干植入對于蝸后病變，包括螺旋神經(jīng)節(jié)、聽神經(jīng)以及聽覺中樞病變需要人工聽覺腦干植入進行干預。經(jīng)迷路入路提供最直接的進入耳蝸核及相關(guān)解剖的路徑[32]，其手術(shù)復雜、風險較高，小型豬的聽覺腦干結(jié)構(gòu)類似于人類，通過在小型豬上模擬進行ABI的過程，可以進行手術(shù)模擬訓練并驗證效果，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2.4 以小型豬為動物模型開展前沿治療方法探索

2.4.1 干細胞治療耳聾研究隨著干細胞技術(shù)快速發(fā)展，干細胞移植治療耳聾在小型豬動物模型中已取得一定進展。目前存在的主要問題包括移植徑路的優(yōu)化，既可將細胞移植損傷部位又可最大程度減小內(nèi)耳損傷[34]。

目前已開展通過小型豬腰椎蛛網(wǎng)膜下腔穿刺-腦脊液途徑移植干細胞治療螺旋神經(jīng)節(jié)細胞以及聽神經(jīng)的病變。實驗研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射途徑移植人臍帶間充質(zhì)干細胞可以遷移至耳蝸,并對其聽性腦干反應(yīng)造成影響[35]。對于毛細胞、聽神經(jīng)都有病變的感音神經(jīng)性耳聾，干細胞移植聯(lián)合植入人工耳蝸,有望達到更好重建聽力的效果。

2.4.2 基于活體基因組編輯的基因治療技術(shù)探索

在成功建立小型豬耳聾動物模型基礎(chǔ)之上，探索基因治療的相關(guān)研究[36]，包括利用腺相關(guān)病毒(adreno-associated virus，AAV)將CRISPR/Cas9導入到早期MITF-/-榮昌豬的內(nèi)耳組織中，以期修復MITF基因的突變，實現(xiàn)基因治療。目前為實現(xiàn)CRIS-PR/Cas9在豬基因組中的高效、定點編輯，已利用豬的成纖維細胞在體外水平篩選出針對榮昌豬突變的高效切割位點，基因組編輯的效率可達到約50%。下一步的工作將集中于CRISPR/Cas9的導入時機和方式以及導入后表型變化的測定[36]。

隨著對豬與人類在解剖和功能方面相似性的認識逐步加深，小型豬作為耳科新型動物模型應(yīng)用日趨成熟，開辟了耳科動物模型的全新領(lǐng)域，有可能引起耳科學基礎(chǔ)研究革命性變化。以此為基礎(chǔ)建立的各種耳聾、眩暈發(fā)病機制研究平臺、人工耳蝸植入實驗平臺、干細胞及基因治療實驗平臺，具有基礎(chǔ)醫(yī)學向臨床醫(yī)學應(yīng)用轉(zhuǎn)化的價值，在聽覺及前庭基礎(chǔ)研究以及臨床耳病相關(guān)研究方面的應(yīng)用前景十分廣闊。目前由于小型豬新型耳科動物模型出現(xiàn)較晚，應(yīng)用不夠廣泛，尚需進一步加強其在耳科研究中的推廣與應(yīng)用。