王 芳 張建中 杜 娟

北京大學人民醫(yī)院皮膚科，北京，100044

系統(tǒng)性硬皮病(systemic sclerosis, SSc)是以皮膚及各內(nèi)臟器官纖維化為特征的自身免疫性皮膚病。該病的發(fā)病機制尚未闡明，與血管損傷、免疫失調(diào)及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)病理性沉積均密切相關[1]。SSc在皮膚、肢端硬化的同時可出現(xiàn)多種內(nèi)臟器官纖維化，包括：肺、消化道、心臟、腎臟等，晚期可出現(xiàn)器官危象，臨床治療棘手。免疫失調(diào)與SSc發(fā)病密切相關，圍繞相關免疫細胞及因子的研究近年來有較多進展。最新二代RNA測序研究發(fā)現(xiàn)：彌漫型SSc患者早期皮損中M2型巨噬細胞(96%)、M1型巨噬細胞(94%)、CD8+T細胞(65%)、CD4+T細胞(60%)及B細胞(69%)表達均較高，可見固有免疫應答和適應性免疫應答在SSc早期均發(fā)揮重要作用；而皮損中巨噬細胞浸潤提示患者病程較長、皮膚硬化程度高[2]。固有免疫是人體防御外源及內(nèi)源性傷害的“第一道”屏障，在激活免疫系統(tǒng)和晚期組織纖維化中均發(fā)揮作用[3]。它通過Toll樣受體識別內(nèi)外源性抗原，并由抗原提呈細胞(如樹突狀細胞等)激活特異性T細胞，建立與適應性免疫應答的聯(lián)系；同時，單核/巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等分泌的促炎細胞因子，如IL-4、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)等，可促進局部炎癥，誘導ECM病理性沉積[4]。目前國內(nèi)文獻針對該領域關注較少[5]，本文將對固有免疫系統(tǒng)中的細胞及相關蛋白、細胞因子等在SSc發(fā)病中的最新研究進展進行綜述。

1 單核/巨噬細胞

單核/巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)者，SSc早期出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷，血液中靜息狀態(tài)的單核細胞M0被募集進入組織，和組織中常駐巨噬細胞Mφ共同引起炎癥反應，巨噬細胞分化為經(jīng)典M1或替代激活M2表型，稱為極化[6]。如該部位炎癥持續(xù)存在，則分泌過多促纖維化細胞因子，引發(fā)ECM病理性聚集[7]。研究表明，SSc患者外周血中單核細胞(CD14+)增加，細胞凋亡減少[8]；Soldano等最新發(fā)現(xiàn)SSc患者血液循環(huán)中的M1(CD80、CD86、TLR2和TLR4標記)/M2(CD163、CD206和CD204標記)雙陽性單核/巨噬細胞百分比顯著高于健康人[9]；而該組患者肺間質(zhì)纖維化和肺動脈高壓的臨床表現(xiàn)更加嚴重[10]。同時，在患者皮損中增厚的膠原束間、血管和附屬器周圍均有單核/巨噬細胞浸潤。

目前發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細胞表達特定的表型標記，包括TLR2、TLR4和共刺激分子CD80和CD86，可被IFN-γ/LPS以及GM-CSF激活，并產(chǎn)生iNOS、IL-12、IL-1β和TNF等炎癥介質(zhì)，促進炎癥反應。相反，抗炎型M2型巨噬細胞主要表達甘露糖受體-1(CD206)和巨噬細胞清除劑受體(CD204和CD163)，體外試驗發(fā)現(xiàn)至少三種亞類的M2型巨噬細胞：M2a(被IL-4和IL-13激活)、M2b(被免疫復合物和LPS激活)和M2c(被IL-10和TGF-β激活)[6]。M2型巨噬細胞與Th2輔助T細胞共同作用，釋放VEGF及抗炎細胞因子IL-10等，參與組織修復相關和纖維化過程[11]。

通常認為M1型巨噬細胞促進炎癥發(fā)生也促進纖維降解，而M2型巨噬細胞緩解炎癥活動也促進纖維形成，但在不同的巨噬細胞表型和不同的微環(huán)境下其作用并不完全一致，M1/M2型細胞在SSc皮膚纖維化中的作用仍有爭議。Higashi-Kuwata等[12]發(fā)現(xiàn)患者皮損中M2型細胞增加且與病情嚴重程度相關，M2型細胞可產(chǎn)生大量TGFβ-1促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化，它還可增加組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteases, TIMP-1)分泌，通過抑制金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性而減少細胞外基質(zhì)降解。M2型細胞可被IL-4激活，在創(chuàng)傷小鼠模型中可通過調(diào)節(jié)IL-4產(chǎn)生促纖維化作用，缺乏IL-4Ra受體或者M2型巨噬細胞相關基因Retnlα(resistin-like alpha)的小鼠在皮膚創(chuàng)傷修復過程中膠原蛋白產(chǎn)生減少[13]。最新發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞分泌大量IL-4和TGFβ-1，并且選擇性通過IL-4/JAK1/STAT6通路促進成纖維細胞活化[14]。

巨噬細胞極化可受多種信號通路調(diào)節(jié)。Wnt/β-catenin通路可促進巨噬細胞活化并向M2型表型轉(zhuǎn)化，促進纖維化進程[15]；而β-catenin的外用抑制劑C-82阻斷該通路，則可以有效改善皮膚纖維化。JAK/STAT通路也可激活巨噬細胞，當該通路受體與IL-4結合可促使胞內(nèi)STAT6磷酸化，導致巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，加速纖維化過程[16]。TGF-β/Smad通路激活也可促使巨噬細胞向促纖維化表型轉(zhuǎn)化，而巨噬細胞自分泌TGF-β可以加速并放大纖維化效應。鑒于巨噬細胞在SSc中的發(fā)病作用，調(diào)節(jié)巨噬細胞活化的信號通路將可能成為疾病治療中的關鍵靶點。

2 肥大細胞

肥大細胞(mast cell)是一種富含致密顆粒的免疫細胞，在防止寄生蟲感染以及過敏性疾病中起關鍵作用。臨床發(fā)現(xiàn)，SSc患者硬化的皮膚中肥大細胞密度顯著增加，且與患者病程、皮膚的改良Rodnan評分以及血清抗拓撲異構酶I抗體正相關，提示該炎癥細胞參與疾病早期炎癥[17]。同時，肥大細胞在原發(fā)性心臟、腎臟和肺部纖維化疾病中均有浸潤[18]。研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞的囊泡是促炎因子(如TNF-α、IL-17等)和促纖維化分子(如IL-4、IL-10及TGF-β等)的儲存庫，可通過脫顆粒釋放或直接與成纖維細胞接觸傳遞炎癥因子[19]。最新發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細胞中由Snail通路介導的纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI1)產(chǎn)生，進而誘導肥大細胞進入真皮，促進成纖維細胞黏附和纖維化[20]。與之相反，有實驗證明肥大細胞為主釋放的組胺可與成纖維細胞膜的H1受體結合，通過抑制TGF-β1/Smad2通路，抑制成纖維細胞分化[21]。整體而言，肥大細胞脫顆粒釋放的細胞因子TGF-β仍是其促纖維化的主要作用。

3 中性粒細胞

中性粒細胞也是固有免疫中的重要一員，可保護機體免受細菌及其他內(nèi)源性危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)等破壞，通過吞噬作用、呼吸鏈、釋放活性氧(reactive oxygen species, ROS)及中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)等發(fā)揮作用。在創(chuàng)傷或病原體入侵部位，中性粒細胞可釋放促炎細胞因子：IL-1α，IL-1β，腫瘤壞死因子(TNF)及IL-6增強防御[22]，“警報解除”后，中性粒細胞凋亡并被巨噬細胞清除，完成使命。目前，中性粒細胞在慢性炎癥及SSc纖維化中的作用并未完全闡明。中性粒細胞是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源，當局部聚集過量的ROS可損傷血管內(nèi)皮[23]。進一步研究發(fā)現(xiàn)：當血管內(nèi)皮持續(xù)損傷并激活聚集的血小板時，可釋放大量SSc微粒(SSc-microparticles)，促進中性粒細胞自噬，蛋白水解增加，同時釋放NETs發(fā)揮促炎作用[24]。NETs在肺和皮膚纖維化標本中與α-SMA陽性的肌成纖維細胞非常近，提示可能存在由中性粒細胞介導的新的纖維化機制[25]。然而另一研究發(fā)現(xiàn)，提取SSc患者血漿和中性粒細胞中的外來體(exosome)-細胞衍生的囊泡，內(nèi)含各種DNA、RNA和蛋白質(zhì)，該外來體可抑制人真皮血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[26]。由此，中性粒細胞在慢性炎癥中是否存在雙向調(diào)節(jié)作用仍值得研究。

4 樹突狀細胞

樹突狀細胞包括傳統(tǒng)樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)。pDC是一種特殊類型的細胞，當被激活時可以釋放大量干擾素(interferon, IFN)。SSc患者皮膚及肺部長期有pDC浸潤，通過產(chǎn)生CXCL4，激活TLR8受體，釋放INF-α促進纖維化；在SSc小鼠模型中敲除pDC后可逆轉(zhuǎn)皮膚纖維化[27]。另一研究也發(fā)現(xiàn)在博來霉素誘導的硬皮病小鼠中敲除pDC后，其臨床評分、肺部病理評分、皮膚厚度和膠原蛋白含量均得到改善；pDC敲除的小鼠肺部改善與趨化因子、樹突狀細胞分化、促炎和纖維化相關的基因表達下調(diào)有關。該研究同時發(fā)現(xiàn)肺組織中浸潤B細胞、T細胞減少，可見pDC在SSc持續(xù)的免疫異常中發(fā)揮作用[28]。pDC如何被調(diào)控？已證實在SSc小鼠中TGF-β可趨化pDC、Th細胞及漿細胞等進入皮膚，而TGF-β拮抗劑可明顯抑制該過程[29]。最新發(fā)現(xiàn)SSc患者皮損pDC中的微小RNA-618(miRNA-618)表達顯著升高，進而增加INF分泌，成為SSc樣pDC表型[30]。此外，用DNA拓撲異構酶I(TopoI)的肽段可誘導DC產(chǎn)生抗TopoI抗體，增加IL-17A和CXCL4促炎因子，導致皮膚和肺部的持續(xù)纖維化[31]，但pDC在抗原提呈、如何與T細胞及其他免疫細胞相互作用等環(huán)節(jié)仍需更多研究。

5 Toll樣受體及其配體

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是固有免疫中識別內(nèi)外源性危險信號的一類重要蛋白分子，也是連接其與適應性免疫的“橋梁”。目前人體中發(fā)現(xiàn)10種，在不同免疫細胞或成纖維細胞的細胞膜或胞吞囊泡中表達，通過識別病原性配體激活胞內(nèi)信號傳導通路。其配體包括外源性病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和DAMPs，DAMPs通常為細胞內(nèi)源性分子，當外傷或應激狀態(tài)下可釋放，觸發(fā)免疫應答，包括內(nèi)源性Ca2+、ATP、自身核酸、熱休克蛋白、ECM片段及損傷的線粒體DNA等[32]。TLRs及其配體在感染、腫瘤、炎癥性疾病和自身免疫病等中均發(fā)揮重要作用，最近證實SSc患者中TLRs表達水平升高[33]。

在人體中，TLR1、2、4、5、6和10為細胞膜蛋白，在巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞或成纖維細胞等中有表達。目前，TLR4及其配體在SSc中的作用研究最為深入。SSc患者皮膚活檢中TLR4、胞外附屬的髓樣分化蛋白和CD14均明顯升高[34]?；蚯贸齌LR4后在博來霉素誘導C57BL/6小鼠和TLR4-/-TSK+硬皮小鼠(the tight skin mouse, TSK)模型中均免于纖維化誘導[35]。組織損傷時，內(nèi)源性DAMPs配體可被TLR4識別，近年來發(fā)現(xiàn)一些新的DAMPs及其作用方式。SSc患者皮膚和血清中的腱生蛋白C(tenascin-C)增加，該細胞外基質(zhì)蛋白的FBG區(qū)域可與巨噬細胞、樹突狀細胞和成纖維細胞上的TLR4受體結合，激活胞內(nèi)MyD88介導的信號通路，促進α-SMA和膠原蛋白生成[36]。同樣，外傷后暴露的纖連蛋白EDA區(qū)域在SSc患者皮膚和血清中也明顯增加，通過激活并釋放TGF-β1，進而促進成纖維細胞分化及分泌ECM[37]。近期體外研究證實，細胞外線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)可促使成纖維細胞表達α-SMA，成為一種新的TLRs配體[38]。此外，TLR2在SSc患者成纖維細胞中表達也顯著升高，通過識別血清淀粉樣蛋白A，促使胞內(nèi)促纖維化細胞因子IL-6釋放[39]。

細胞內(nèi)TLRs包括TLR3、7、8和9，這組蛋白可敏感監(jiān)測病毒來源的核酸片段。TLR3經(jīng)IFN1刺激后分泌增加，進一步增加IL-6和單核細胞趨化蛋白-1表達，招募更多巨噬細胞進入組織中[40]，而后者是固有免疫中重要的調(diào)節(jié)者。TLR7/8是單鏈RNA(ssRNA)的受體，被激活后通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)的分泌，進而抑制細胞外基質(zhì)降解，促進皮膚纖維化。TLR8還可通過增加樹突狀細胞分泌的CXCL4誘導纖維化[27]。TLR9在SSc皮膚樣本的肌成纖維細胞中表達也升高，可識別雙鏈DNA(dsDNA)的非甲基化CpG序列，通過MyD88通路促進TGF-β大量分泌，促進成纖維細胞分化發(fā)揮作用[41]。隨著TLRs在SSc發(fā)病機制中的研究，目前針對阻斷DAMPs配體、TLRs受體(TLR2、4、7、8等)及下游信號通路的小分子靶向藥物成為治療本病的熱點之一[33]。

6 相關細胞因子

SSc炎癥中有很多細胞因子參與，在皮膚、肺部及血清中均有不同程度升高，目前針對IL-4、IL-6 和TGF-β的研究較為深入。研究發(fā)現(xiàn)IL-4可促進成纖維細胞合成膠原蛋白及其他ECM，IL-4抗體可抑制TSK硬皮小鼠纖維化；同樣的，敲除TSK小鼠的IL-4受體也可見纖維化減輕[42]。TGF-β是成纖維細胞分化為肌成纖維細胞中最重要的細胞因子，它可以激活TGF-β/Smad通路，促進膠原蛋白I、III型、纖連蛋白等ECM蛋白合成；同時它可以促進成纖維細胞自分泌TGF-β，放大纖維化過程[43]。TGF-β還可通過MAPK、JNK和ERK1等非Smad通路調(diào)節(jié)炎癥反應[44]。IL-6在SSc早期和晚期均發(fā)揮作用，IL-6敲除的小鼠纖維化作用明顯減弱；IL-6及其受體可通過IL-6/STAT3通路促進膠原蛋白分泌[44]。目前針對IL-6受體的托珠單抗(tocilizumab)已發(fā)現(xiàn)可有效改善SSc患者皮膚硬化，有望成為新的治療藥物[45]。

7 總結

SSc發(fā)病機制復雜，大量證據(jù)表明固有免疫對于啟動免疫系統(tǒng)至關重要，多種細胞及分子參與了病理過程中血管損傷、免疫細胞激活及纖維化的過程。其中，TLRs及其配體、巨噬細胞發(fā)揮重要作用，其與適應性免疫的T細胞、B細胞相互作用，并有其他細胞因子、趨化因子等參與，最終調(diào)節(jié)成纖維細胞分化、及ECM合成及降解的平衡。未來對于各類固有免疫細胞的病理學作用的精細研究及針對特定細胞亞群或分子研制相應的靶點研究，將有助于SSc臨床評估及新藥物研發(fā)。