周秋君 魏申譽 柴世牽 曹毅 陶茂燦

肝細胞癌占原發(fā)性肝癌的75%以上，是全球癌癥相關的第4大死因，由于肝癌具有較高的隱匿性以及缺乏可靠的早期診斷指標，大多數(shù)肝癌患者在首次確診時已經(jīng)處于晚期因而難以進行有效的根治性治療，往往只能依靠于姑息性的藥物治療，而一線藥物例如多激酶抑制劑索拉菲尼或侖伐替尼也僅能延長晚期肝癌患者3個月左右的生存期[1]。近年來，由于免疫治療在黑色素瘤、非小細胞肺癌等癌癥中的成功應用而備受關注。然而由于肝臟所固有的低免疫源性，導致肝癌在發(fā)生、發(fā)展中形成了免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，造成了較低的免疫治療陽性反應率[2]。隨著研究的深入，外泌體在肝癌中作為腫瘤細胞與免疫細胞間交流的一種重要方式而逐漸被人們認知，其在免疫抑制性信號傳導、促進腫瘤微環(huán)境的形成以及促進腫瘤細胞免疫逃逸的過程中均扮演重要角色，故而有必要深入了解其在影響肝癌進展中所起的重要機制，以針對性的開發(fā)出免疫治療新療法[3]。

1 外泌體簡介

外泌體是直徑30～100 nm的膜性囊泡，幾乎能夠被所有種類的細胞所分泌，參與各種生理、病理過程，且通常能在各種體液包括血液、尿液、唾液等中被檢測到[4]。外泌體負責細胞間信號交流，通過受體配體結合及內(nèi)吞入靶細胞等方式進行，并且能夠轉運各種生物分子，比如蛋白質、脂質、mRNAs、非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA、miRNAs以及環(huán)狀RNA等[5]。由于外泌體微囊泡膜結構能夠較好地保護核酸等遺傳物質，使得外泌體所攜帶的生物學信息能夠被用于監(jiān)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有望成為良好的生物標志物。在肝癌中，已知的外泌體所介導的腫瘤生物學行為包括血管生成、免疫抑制、遠處轉移、耐藥等[6]。

2 外泌體在腫瘤免疫中的雙重作用

腫瘤細胞的生物學行為不僅僅取決于腫瘤細胞本身，也受到腫瘤細胞與其所處腫瘤微環(huán)境的相互作用的調節(jié)，而來源于腫瘤細胞與免疫細胞的外泌體共同調節(jié)了機體的免疫反應進程[7]。在腫瘤發(fā)生過程中，各類抗原呈遞細胞（APC）包括樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞等通過吞噬各種腫瘤抗原并將其呈遞至主要組織相容性復合物（MHC）分子上并與T細胞特異性結合以啟動免疫反應，此過程被稱為免疫突觸[8]。與此同時，也有證據(jù)表明APC會通過分泌擁有抗原呈遞作用的外泌體來激活更多免疫效應細胞，并且被激活后的T細胞也會分泌外泌體以進一步促進抗腫瘤炎性反應[9]。然而，在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細胞也會通過直接或間接方式塑造免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，以此來逃避或抑制免疫細胞的殺傷作用。腫瘤細胞可以通過多種方式逃避免疫監(jiān)視并誘導免疫耐受，其中就包括釋放腫瘤細胞來源的外泌體（TEX）[10]。有趣的是，一方面，腫瘤細胞來源的外泌體由于自身呈遞腫瘤相關抗原可以誘導、增強抗腫瘤免疫反應；另一方面，腫瘤細胞來源的外泌體也可通過各種細胞間通訊的方式抑制免疫細胞正常功能，例如誘導免疫細胞抑制性的表型生成以及通過信號傳導啟動免疫細胞程序性死亡[11]。

3 外泌體抗原呈遞激活肝癌免疫反應

在肝癌中，無論是免疫細胞來源的亦或是腫瘤細胞來源的包含腫瘤抗原的外泌體均能通過抗原呈遞的方式來誘導和增強機體抗腫瘤免疫反應，并且某些免疫細胞來源的外泌體對于肝癌細胞有直接抑制或殺傷作用。DC細胞作為最主要的抗原呈遞細胞在T細胞的啟動中扮演著不可或缺的角色，在吞噬腫瘤抗原后它能夠釋放表達MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ大分子的外泌體，進一步激活免疫反應[12]。有報道顯示，來源于小鼠肝癌細胞系的TEX能夠激活并促進DC細胞的成熟，提升其表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的水平，并且TEX與傳統(tǒng)腫瘤細胞溶解產(chǎn)物激活DC細胞相比能帶來更強的體內(nèi)以及體外免疫反應[13]。另外，在原位肝癌小鼠中，TEX處理的DC細胞顯著改善了肝癌腫瘤微環(huán)境：T效應淋巴細胞數(shù)量增多，IFN-γ水平提升，IL-10以及腫瘤生長因子β（TGF-β）降低。由此可見，TEX能通過激活DC細胞啟動T細胞的免疫殺傷效應，為外泌體抗腫瘤治療提供了嶄新的臨床應用前景。NK細胞是一類無需預先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞的免疫細胞，之前有報道，肝癌細胞釋放的外泌體包含應激誘導熱休克蛋白（HSP），能夠顯著激活NK細胞并促進其殺傷腫瘤效應[14]。并且這種殺傷效應是通過NK細胞識別腫瘤細胞上自然殺傷細胞活化型受體（NKG2D）的配體來實現(xiàn)的。最近有研究發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥（如卡鉑）在治療肝癌的過程中能夠誘導肝癌細胞釋放包含HSP70的外泌體，由此增強了肝癌腫瘤免疫源性并激活了NK細胞[14]。除了TEX的免疫激活效果，免疫細胞源性的外泌體也能夠起到抗腫瘤的效果。例如，巨噬細胞來源的外泌體如miR-223和miR-142，可通過細胞間交流的形式抑制肝癌中某些基因轉錄后蛋白水平的表達，抑制微管不穩(wěn)定蛋白1和胰島素樣生長因子1的分泌及肝癌細胞的增殖[15]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6基因能夠通過上調肝癌細胞TEX的miRNA let-7i-5p表達，從而抑制TSP1蛋白表達并占據(jù)CD47受體，最終阻斷巨噬細胞中CD47-SIRPα通路介導的抗吞噬作用，從而抑制肝癌腫瘤發(fā)生[16]。以上研究均顯示出腫瘤來源的外泌體作為肝癌免疫治療增強腫瘤免疫源性的巨大潛力，有望于成為肝癌免疫治療的腫瘤疫苗。

4 外泌體促進肝癌免疫逃逸

盡管在癌癥發(fā)生過程中外泌體對于機體免疫系統(tǒng)的激活起到了一定的幫助，但是大量的研究表明，在腫瘤進展過程中，外泌體所產(chǎn)生的免疫抑制效應導致了癌癥不可逆的進展，其中外泌體對于免疫細胞的調節(jié)作用至關重要[17]。

4.1 巨噬細胞 巨噬細胞通常是由外周血中單核細胞募集、分化而來，在肝癌腫瘤微環(huán)境的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色。生理狀態(tài)下，單核細胞通常會在2 d內(nèi)發(fā)生凋亡，然而在腫瘤驅動的慢性持續(xù)性炎癥狀態(tài)下，單核細胞會被持續(xù)動員募集進入肝癌腫瘤微環(huán)境，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近期的研究表明，肝癌TEX在單核細胞的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中激活了Ras和細胞外信號調節(jié)激酶，阻止了半胱天冬酶的裂解，從而抑制了單核細胞的凋亡，進而促進了腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的募集[18]。另外，敲低試驗驗證了TEX是通過其裝載的磷酸化受體酪氨酸激酶如磷酸化上皮生長因子和人上皮生長因子受體2激活MAPK通路的。此外，隨著肝癌的進展，TAM逐漸由抗腫瘤的M1型巨噬細胞極化為促癌的M2型巨噬細胞，其中肝癌TEX所運載的ncRNA亦起到重要作用。有研究顯示，肝癌細胞分泌lncRNA TUC339通過TEX細胞間交流方式運輸至TAM中，促進了TAM向M2表型的極化[19]。在TAM中沉默TUC339可顯著增加促炎細胞因子的產(chǎn)生、共刺激分子的表達以及細胞吞噬作用的增強，而過表達試驗恰恰相反。此外，芯片技術顯示TUC339在巨噬細胞中可通過與CXCR趨化因子受體結合、Toll樣受體信號通路等發(fā)揮作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)肝癌TEX中轉錄因子Sal樣蛋白2能夠上調miR-146a-5p的表達，并激活NF-κB信號通路、誘導促炎因子表達，從而重塑巨噬細胞表型，使其極化為M2型巨噬細胞[20]。由此M2型巨噬細胞上調了效應T細胞中PD-L1和CTL4的表達，促進了效應T細胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的耗竭，助長了肝癌腫瘤免疫抑制微環(huán)境。且內(nèi)質網(wǎng)應激對于腫瘤細胞發(fā)揮免疫逃逸及藥物抵抗有很強的促進作用。在衣霉素處理的肝癌細胞TEX中，miR-23a-3p被發(fā)現(xiàn)顯著上調，并且與巨噬細胞中程序性死亡配體-L1（PD-L1）的含量呈正相關[21]。進一步研究表明，肝癌TEX來源的miR-23a-3p可通過PTENAKT通路上調巨噬細胞內(nèi)PD-L1表達從而促進巨噬細胞死亡，并進一步抑制了CD8+T細胞以及IL-12的產(chǎn)生，從而促進了免疫抑制環(huán)境的形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過抑制肝癌TEX中STAT3通路的激活來下調巨噬細胞中PD-L1的表達，并同時抑制了IL-6、IL-10以及TNF-α等在巨噬細胞中的表達，表明了褪黑素對于緩解腫瘤免疫抑制狀態(tài)的潛在作用[22]。

4.2 T淋巴細胞與B淋巴細胞 T淋巴細胞可根據(jù)其功能分為CD4+和CD8+T細胞兩大類，其中CD4+T細胞在腫瘤免疫中主要為輔助功能，負責抗體產(chǎn)生與釋放、CD8+T細胞的激活，而CD8+T細胞主要負責識別與殺傷腫瘤細胞。然而，腫瘤來源的外泌體卻能夠通過抑制Th1反應來誘導CD4+CD25+的調節(jié)性T細胞產(chǎn)生（Treg）的生成，而效應T細胞PD-1、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子（TIM-3）等可誘導T細胞程序性死亡或進入休眠狀態(tài)，從而逃避免疫細胞的監(jiān)視功能[23]。大多數(shù)外泌體并非是通過被攝取的方式進入T細胞從而進行細胞間交流的，而是與細胞表面受體結合從而傳導信號或調節(jié)T細胞功能[24]。也有部分外泌體通過間接地調節(jié)巨噬細胞表型轉換，以M2型巨噬細胞誘導效應T細胞的耗竭或是通過抑制DC細胞激活從而阻斷T細胞激活，這些研究上文均已列舉過[20-21]。最近有報道顯示，14-3-3ζ在肝癌細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中均有高表達，且其高表達與免疫激活抑制、免疫細胞增殖以及抗腫瘤功能相關[25]。在外周血CD3+T細胞中，14-3-3ζ高表達時PD-1、TIM-3、淋巴細胞激活基因3與細胞毒T淋巴細胞相關抗原4等抑制性受體顯著升高，且其增殖和活動受到抑制。另外，肝癌中高表達14-3-3ζ的TEX可直接被T細胞吞噬，由此可證明肝癌細胞中14-3-3ζ通過外泌體的形式被轉運到T細胞內(nèi)，并且介導了幼稚T細胞向Treg細胞而非效應T細胞的分化偏移。此外，亦有報道稱主要組織相容性復合物Ⅰ（MIC）A/B和視磺酸轉錄本1/UL16結合蛋白（RAET1/ULBP）家族在肝癌TED中顯著富集，其中MICA和ULBP能夠通過外泌體途徑抑制NKG2D信號通路，從而削弱細胞毒性T細胞的腫瘤殺傷功能，且裝載TGF-β的外泌體能夠抑制CD8+T細胞的激活[26]。

B淋巴細胞是體液免疫的主要組成部分，其不僅能夠分泌特異性抗體，也具有部分抗原呈遞功能，其中調節(jié)性B細胞（Breg）在肝癌中與不良預后有著顯著聯(lián)系[27]。在肝癌患者的腫瘤組織中，TIM-1+Breg細胞的浸潤水平顯著升高，呈現(xiàn)CD5highCD24-CD27-/+CD38+的表型，這促進了免疫抑制細胞因子IL-10的過表達并顯著抑制了CD8+T細胞的免疫活性。而經(jīng)過肝癌TEX處理后的B細胞也呈現(xiàn)出了相同的表型，這些都與肝癌晚期分期及早期復發(fā)相聯(lián)系。進一步研究顯示，外泌體來源的HMGB1激活了B細胞并可通過TLR2/4及MAPK通路誘導其表型轉換及擴增[28]。

5 外泌體相關肝癌免疫治療的方法及進展

針對外泌體相關肝癌免疫治療方法包括誘導、增強機體自身免疫力，以及通過藥物阻斷免疫抑制相關通路。由于腫瘤來源的外泌體能夠顯著增強腫瘤免疫源性，激發(fā)相關抗原呈遞細胞活化，因此一系列通過腫瘤細胞來源或免疫細胞來源的外泌體誘導免疫增強的試驗已經(jīng)展開[13，29-30]。其中呈遞甲胎蛋白（AFP）的DC細胞來源的外泌體（DEXAFP）在異位、原位及誘導肝癌小鼠模型中均產(chǎn)生了較強的抗原特異性免疫反應，并抑制了腫瘤生長，延長了生存時間，小鼠肝癌腫瘤微環(huán)境得以明顯改善，表達IFN-γ的CD8+T細胞明顯增加，IFN-γ及IL-2水平也均明顯增加，并且CD25+Foxp3+Treg細胞及IL-10水平在腫瘤組織中明顯減少[29]。利用重組腺相關病毒載體攜帶AFP基因加載人外周血來源的DC細胞，制備出高純度DEXAFP[30]。DEXAFP能夠有效刺激naveT細胞增殖并誘導T細胞激活為抗原特異性細胞毒性T細胞，有效抑制肝癌生長。這兩項研究均提示DC細胞來源的外泌體有望成為免疫療法中的肝癌疫苗。

近期，一項關于腫瘤細胞來源的外泌體PD-L1的研究提示，來自腫瘤細胞的外泌體PD-L1能夠抑制引流淋巴結T細胞的活化，而去除外泌體PD-L1可抑制腫瘤生長，即使在抗PD-L1抗體的模型中也是如此，這項研究盡管未在肝癌細胞系中展開，但也提示外泌體PD-L1可作為一種有效的抗免疫檢查點抑制劑耐藥的方法[11]。

6 小結

綜上所述，外泌體作為一種新型細胞間通訊方式，在腫瘤細胞及機體免疫細胞的相互作用中扮演了不可替代的角色。外泌體能夠有效激活機體免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細胞，促進抗腫瘤免疫反應，為外泌體抗肝癌治療提供新思路，為無細胞肝癌疫苗的誕生奠定了基礎。同時，外泌體在肝癌免疫抑制微環(huán)境的塑造過程中起到促進肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉移的作用，本文詳細闡述了肝癌患者外泌體對于幾種主要免疫細胞的影響機制，并揭示了它們在肝癌進展中起到的作用。在未來的研究中，應該更加注重對于外泌體在免疫抑制通路方面的研究，以獲取更多潛在的針對性治療靶點，更好地應用于臨床實踐。