辛 亮，張?zhí)m威*

（1.清華大學醫(yī)學院 清華大學-北京大學生命科學聯(lián)合中心，北京 100084；2.哈爾濱工業(yè)大學化工學院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

食品病原微生物是威脅人類健康的重大問題。美國疾病控制中心數(shù)據(jù)顯示，每年病原微生物污染的食品導致約4 800萬 人患病，128 000 人住院，僅在美國每年就有3 000 人死亡[1-2]。引起食源性疾病爆發(fā)的主要病原微生物為Salmonellaspp.、Escherichia coliO157:H7、Listeria monocytogenes、Clostridium perfringens、Norovirus、Hepatitis A、Cryptosporidium、Cyclospora和Toxoplasma，這些病原微生物可以通過空氣、水和土壤等傳播，在食品加工、運輸和貯存等階段污染食品[3-5]。

傳統(tǒng)的食品微生物檢測采用平板培養(yǎng)結合生化鑒定的方法[6]。雖然該方法成本低廉，但是操作繁瑣、耗時久，檢測速度受到微生物在不同培養(yǎng)基中生長能力的限制，通常需要2～3 d進行初步鑒定，一周以上才能確認微生物種類[7]；由于存在不可培養(yǎng)微生物，傳統(tǒng)檢測方法會出現(xiàn)假陰性結果，增加了病原微生物的傳播風險[8]。基于核酸檢測方法的優(yōu)勢在于能夠短時間內(nèi)大量擴增樣品中低水平目標微生物的核酸，這是研究人員將研究轉向基于核酸檢測方法的主要原因[9]。在過去的幾十年里，核酸檢測方法廣泛發(fā)展，但由于食物成分復雜，往往需要樣品前處理以及昂貴的設備和有經(jīng)驗的實驗操作人員，現(xiàn)場和普通工業(yè)實驗室無法達到檢測要求[10]。近年來，微流控系統(tǒng)的出現(xiàn)為食品病原微生物的高效檢測提供了強大技術基礎。2006年，Whitesides定義了微流控技術，它是指利用微米級通道精確地操控微量流體[11]。微流控芯片體積小，試劑和樣品消耗少，而且便于攜帶，可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測[12]；微流控芯片的比表面積高，傳質和傳熱速率快，可有效縮短檢測時間；而且微流控芯片設計靈活，可將多個實驗集成至單個微流控芯片，實現(xiàn)高通量檢測，極大提高檢測效率的同時，避免樣品在檢測過程中出現(xiàn)交叉污染[13]。

目前，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴增（recombinant polymerase amplification，RPA）、依賴核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和解旋酶依賴擴增（helicase dependent amplification，HDA）等方法均已結合微流控芯片應用于食品病原微生物的檢測。微流控芯片與核酸擴增技術的結合為從復雜的食物基質中簡便高效地檢測病原微生物提供了新的可能。本文對近年來核酸擴增結合微流控芯片檢測食品病原微生物的相關技術進展進行介紹。

1 PCR-微流控芯片檢測食品病原微生物

PCR技術的發(fā)展在分子生物學上引起了一場革命，它使DNA分子的擴增可在短時間內(nèi)跨越多個數(shù)量級[14]。PCR反應通常包括3 個步驟：變性、退火和延伸。在變性（≈95 ℃）步驟中，雙鏈DNA變成兩條單鏈，經(jīng)退火（≈56 ℃）步驟降低溫度，使引物與單鏈DNA模板結合；在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料進行延伸，合成一條與模板鏈互補的半保留復制鏈，如此循環(huán)獲得大量目標基因；為保證聚合酶活性，延伸溫度通常設置為72 ℃左右[15]。自1998年PCR技術首次與微流控芯片結合應用以來，越來越多的研究人員深入發(fā)展PCR-微流控芯片[16]。PCR-微流控芯片檢測利用微流控器件熱質量小和比表面積高的特點實現(xiàn)快速傳熱，從而縮短PCR擴增過程中穩(wěn)定溫度所需的時間。與傳統(tǒng)PCR相比，PCR-微流控芯片可以獲得更均勻的體系溫度，有助于提高擴增產(chǎn)量，使檢測更靈敏。

PCR-微流控芯片逐漸成為食源性致病菌檢測的研究熱點。Salman等建立了一種分流PCR方法，采用并聯(lián)熱循環(huán)器使微流控芯片的反應室在不同的溫度區(qū)域之間移動，反應體系于期望溫度處停留相應的反應時間，完成PCR過程。反應裝置中的3 塊加熱板取代了價格昂貴且笨重的PCR儀[17]。該體系對于E.coli的檢測限（limit of detection，LOD）低至0.7 ng/μL，且所用設備簡單，檢測成本低，具有極強的可應用性。

提高微生物DNA提取效率可有效提高PCR-微流控芯片的檢測靈敏度。Zhang Huilin等設計同軸通道的DNA提取微流控芯片[18]。首先，將磁性玻璃珠泵入同軸通道，通過施加多環(huán)高梯度磁場使其在通道中均勻分布。然后將E.coliO157:H7裂解，釋放胞內(nèi)物質于同軸通道，磁性玻璃珠高效提取其中的DNA，提取量較之前的空心毛細管通道提高了4 倍左右，LOD低至12 CFU/mL，該方法具有檢測較低水平E.coliO157:H7的能力[18]。

食品病原微生物的檢測經(jīng)常需要多個目標同時檢測，不同引物之間的相互競爭和抑制影響液相PCR的檢測效果。研究人員嘗試將多對引物固定于支持物上，以類似于原位PCR的方式一次性對樣品中的多個目的片段進行擴增，避免了引物種類過多帶來的干擾，這種方法稱為固相PCR（solid phase PCR，SP-PCR）[19]。Hung等基于超臨界角熒光（super critical angle fluorescence，SAF）原理設計微透鏡陣列微流控芯片，并將SP-PCR引物嵌入陣列中，實現(xiàn)了4 種目的基因同時檢測，結果表明該方法特異性強，并且SAF設計可將LOD優(yōu)化至1.6 拷貝數(shù)/μL，為微流控芯片檢測提供了新的研究方向[20]。

PCR-微流控芯片的檢測方法仍然存在一定問題，例如連續(xù)單向流動PCR體系容易被微流控芯片通道表面吸附，通道中心與接近表面區(qū)域的流速不同造成熱循環(huán)中PCR反應體系的停留時間存在誤差等。這些問題一定程度上限制了PCR-微流控芯片檢測的應用[21]。

2 等溫擴增-微流控芯片檢測食品病原微生物

等溫擴增技術的出現(xiàn)解決了PCR變溫過程帶來的弊端，其體系在等溫條件下擴增效率良好，所需能量減少，儀器要求降低。將等溫擴增技術與微流控芯片結合可以開發(fā)更簡便高效的檢測平臺，使非專業(yè)技術人員能夠在實驗室外進行操作[22]。近十年，多種等溫擴增方法已與微流控芯片結合應用于食品病原微生物的檢測中。

2.1 LAMP-微流控芯片檢測食品病原微生物

LAMP由Notomi等于2000年建立，是近年來應用最廣泛的等溫擴增技術[23]。LAMP的基本原理是設計2～3 套引物，60～65 ℃恒溫條件下，利用BstDNA聚合酶的高鏈置換活性和復制活性介導DNA鏈的循環(huán)置換合成，30～60 min內(nèi)即可得到目的基因的106～109拷貝數(shù)[24]。

離心式微流控芯片是微流控檢測領域近年的創(chuàng)新熱點。離心式微流控芯片呈光碟形狀，上置多個反應單元。反應起始、試劑混合、儲存和計量等均由圓盤的旋轉控制。因其設計靈活、操作簡單且通用性強得到廣泛應用[25]。Nguyen等將LAMP與微流控芯片結合，建立了一種便攜離心檢測裝置。首先，將樣品加入芯片，然后利用離心力將儲存于芯片試劑盒中的試劑釋放至指定區(qū)域與樣品混合，發(fā)生LAMP反應（圖1[26]）。反應結束后，通過比色法對檢測結果進行分析。該裝置可在1 h內(nèi)完成對E.coliO157:H7、Salmonella typhimurium和Vibrio parahaemolyticus的檢測，LOD均為102個/mL[26]。另有研究將生物素-鏈霉親和素試紙條與離心式LAMP-微流控芯片結合，用于判定檢測終點，無需儀器或人工干預，進一步簡化了檢測流程。該系統(tǒng)用于乳中S.typhimurium和V.parahaemolyticus的多重檢測，反應80 min的LOD可達50 CFU[27]。LAMP-微流控芯片通常需要其他設備輔助調(diào)控反應溫度，存在一定誤差，影響檢測效率，芯片的精確測溫和加熱系統(tǒng)設計仍存在很大挑戰(zhàn)。Lim等提出了一種基于離心式微流控芯片的自動回路LAMP檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用熱變色涂層遠距離測量腔體內(nèi)部溫度，并在腔體內(nèi)覆蓋一層微石墨膜，超高速遠程吸收激光束，實現(xiàn)無物理接觸的溫度測量和加熱。實驗結果表明，該方法能夠有效地實現(xiàn)LAMP檢測，靈敏度仍需進一步提高[28]。

近年來智能手機應用普遍，無線通信技術快速發(fā)展。智能手機中包埋若干感應器，例如攝像頭和音頻插口。智能手機和微流控芯片均具有易操作和便攜帶的特點，基于微流控芯片和智能手機傳感器可以開發(fā)一系列應用程序，支持實驗室外的食品病原微生物檢測[29]。Sayad等設計離心式LAMP芯片，自動完成LAMP反應后，采用鈣黃綠素比色法判定檢測終點。紫外線發(fā)射器（365 nm）激發(fā)鈣黃綠素，光學傳感器識別發(fā)射光并導入電機，通過無線藍牙電子系統(tǒng)將信號傳輸?shù)街悄苁謾C，完成檢測結果的輸出。將該方法用于雞肉中E.coli、Salmonellaspp.和Vibrio cholerae的檢測，60 min的LOD為3×10-5ng/μL DNA[30]。智能手機與微流控芯片的結合提供了強大的實驗操作平臺，以移動方式實現(xiàn)遠端的數(shù)據(jù)分析和管理。

離心力可以使離心式微流控芯片中的LAMP反應體系自動配置，濾紙的毛細效應也有相應功能。Pang Bo等設計了聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）/紙芯片用于LAMP檢測，該芯片由3 層組成，分別為中央進液層、反應層和支撐層，其中，浸有LAMP引物的濾紙片位于支持層和反應層之間（圖2[31]）。當LAMP其余反應成分和樣品注入芯片后，濾紙片將其吸入并與引物混合，開始LAMP反應，反應終點由羥基萘酚藍和SYBR Green I染料判定。該芯片多重檢測蝦肉中Staphylococcus aureus和V.parahaemolyticus結果的LOD為103CFU/mL[31]。雖然此方法的LOD并不理想，但是裝置的制作無需精密光刻且反應過程無需離心裝置，具有應用于資源匱乏地區(qū)的潛力。

LAMP-微流控芯片檢測所用試劑價格低、靈敏度高、特異性強，反應過程中無需熱循環(huán)。而且LAMP對模板要求低于PCR，可以在復雜的生物基質中進行，因此，LAMP-微流控芯片具有現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)勢；LAMP-微流控芯片檢測也存在一些問題，例如檢測需要設計多對引物，較為復雜，對于未知序列的目標基因無法檢測等[32]。

2.2 RPA-微流控芯片檢測食品病原微生物

RPA是一種等溫擴增方法，自2006年發(fā)表以來，引起了研究人員的重點關注。RPA反應的第一步是引物與E.coliRecA重組酶結合形成復合體，當復合體搜索到模板中存在的引物互補序列后，重組酶打開雙鏈DNA，引物與同源序列發(fā)生鏈置換，形成D-loop復合物，單鏈核酸結合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）隨即與互補鏈結合，穩(wěn)定引物。重組酶解離后，DNA聚合酶識別引物3’端并啟動DNA擴增反應，新生成的DNA鏈可作為下一輪RPA的模板[33]。RPA操作溫度為37～40 ℃，反應效率高，獲得104拷貝數(shù)僅需10 min左右[34]。

Lutz等于2010年首次提出RPA-微流控芯片檢測雙鏈DNA的方法，并以mecA的PCR擴增產(chǎn)物分析了該方法檢測S.aureus的可行性[35]。目前，已有研究將RPA檢測食品病原微生物的全過程集成于單個微流控芯片。Kim等開發(fā)了一種用于食品中Salmonella enteritidis檢測的離心式微流控芯片。首先，利用免疫磁珠對樣品中的少量檢測目標進行富集，然后激光二極管驅動閥門打開使樣品進入反應室，再由激光調(diào)節(jié)溫度開始反應。當反應結束后，通過離心力將樣品送入稀釋室，最后通過反應體系與橫向流動試紙條反應表征檢測結果。將該裝置用于乳中S.enteritidis的檢測僅需不到30 min，LOD為102CFU/mL[36]。Kunze等也建立了一種RPA-微流控芯片的集成檢測方法，該方法中設計了微陣列芯片，結合化學發(fā)光法分析檢測結果，應用于Enterococcus faecalis的檢測，48 min的LOD為5×103基因組/μL[37]。

滑動芯片自2009年創(chuàng)建以來，以其操作簡單、無需泵或閥門輸送液體的特點備受關注。滑動芯片由頂板和底板組成，兩塊板放在一起并相對滑動使試劑在重疊部分進行交換并發(fā)生反應[38]。頂板和底板組合后共有6 個重復反應孔和2 個陰性對照孔，對照孔中一個無DNA，一個無乙酸鎂；縱向側視圖中演示加載配置。用移液槍將DNA樣本、RPA體系和乙酸鎂分別裝入樣本孔中；側視圖顯示了設備的尺寸和特征。Tsaloglou等將RPA與滑動芯片結合（圖3[39]），以tacB為靶基因，實時檢測Clostridium difficile的LOD為103DNA 拷貝數(shù)，用時不到20 min[39]。

圖3 滑動芯片示意圖[39]Fig.3 Schematic illustration of the slip chip[39]

RPA-微流控檢測特異性強、靈敏度高，對樣本純度要求較低，無需DNA初始加熱變性步驟。但是，RPA的引物長度通常大于30 bp，有一定合成難度且體系較難優(yōu)化。

2.3 NASBA-微流控芯片檢測食品病原微生物

NASBA由Compton于1991年發(fā)明，該技術是以RNA為模板的等溫擴增技術[40]。NASBA體系中包括兩條根據(jù)檢測目標設計的引物、逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）、RNase H和T7 RNA聚合酶。NASBA反應過程中，第一條引物的5’端與T7 RNA聚合酶連接并與模板中的互補位置結合，引導RT合成RNA模板的互補DNA鏈；然后，RNase H破壞RNA模板，第二條引物結合在（反義）DNA鏈的5’端，RT再次延伸引物合成另一條DNA鏈，產(chǎn)生雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶以DNA鏈為模板合成互補的RNA拷貝，每個新合成的RNA都是下一個循環(huán)階段的模板，RNA指數(shù)擴增。NASBA于41 ℃反應1.5 h可以產(chǎn)生約1010的目標RNA[41]。

NASBA可將mRNA、rRNA、tmRNA、SSDNA和病毒的核酸作為檢測目標。其中，由ssrA編碼的tmRNA較為穩(wěn)定，接近DNA的魯棒性，是很好的檢測目標。Dimov等將tmRNA純化和NASBA檢測集成于單個微流控芯片，用于E.coli的實時檢測，結果表明102CFU/μL的E.coli檢測用時為30 min[42]。為提高NASBA的檢測效率，Zhao Xinyan等致力于改良檢測過程中RNA的提取方法，先后設計免疫提取RNA和膜富集RNA的NASBA微流控芯片，其中，后者的檢測效果較好[43-44]。膜富集RNA-NASBA應用于水中Saccharomyces cerevisiae、S.aureus和E.coli檢測的LOD均為64 CFU/L。而且該芯片設計依照96 孔板的尺寸，熒光強度判定檢測結果可使用酶標儀完成，實現(xiàn)檢測結果實時輸出。Chung等也對芯片中RNA的提取方法進行了改良，并將其應用于牡蠣中Norovirus的檢測，實驗首先將污染的牡蠣進行研磨，取上清液注入芯片，然后利用電物理法將病毒吸附在微球上并進一步打漿溶解。隨后將提取的RNA轉移到檢測室，進行NASBA擴增。經(jīng)體系優(yōu)化后，牡蠣中Norovirus的LOD為102PFU/個[45]。

NASBA-微流控芯片的檢測目標為RNA，因此樣品中的死細胞對檢測結果無干擾，檢測結果更準確，而且檢測靈敏度高、特異性強、成本低。但是，當樣品中大部分為雙鏈DNA時，NASBA需要95 ℃輔助初始變性；當樣品中大部分為RNA時，需要溫和的熱處理（65 ℃）去除二級結構。因此，NASBA并非完全等溫擴增，對微流控芯片的設計和使用提出了更高要求。

2.4 HDA-微流控芯片檢測食品病原微生物

HDA是由Vincent等在2004年首次報道的一種恒溫擴增技術，該技術中DNA解旋酶在ATP驅動下打開DNA雙鏈，SSB結合單鏈DNA防止降解，同時，一對與DNA模板互補的特異性引物退火結合到模板的3’端，此時，無核酸外切酶活性的大片段DNA聚合酶沿著引物延伸合成新的雙鏈DNA。新合成的雙鏈DNA作為模板在DNA解旋酶的作用下進入下一輪擴增反應，使DNA呈指數(shù)擴增[46]。

經(jīng)過近些年的發(fā)展，HDA檢測的全過程已經(jīng)可以整合至單一芯片。Mahalanabis等通過瓣閥和疏水性排氣孔驅動芯片中的液體流動，在單一芯片上完成HDA檢測的全過程，極大地減少了繁瑣操作。將該芯片用于E.coli檢測的LOD可達10 CFU，用時50 min[47]。另有研究人員利用二氧化硅超順磁粒子進行DNA的固相提取和反應體系的驅動，實現(xiàn)HDA-微流控芯片檢測分析一體化。該方法以E.coli為模式生物，驗證了其可行性[48]。常見的微流控芯片以玻璃、硅和PDMS作為基質，雖然實現(xiàn)了裝置小型化，但仍存在成本相對較高的問題。紙可以作為降低成本的一種選擇。盡管紙基芯片缺乏高分辨率和高靈敏度，但對于工業(yè)化程度較低的國家，尤其是對需要持續(xù)測試的情況，紙基芯片成為非常有吸引力的替代裝置[49]。Tang Ruihua等將核酸提取、HDA檢測和橫向流動試紙條分析整合在紙芯片中，對廢水、果汁、牛奶和雞蛋中的S.typhimurium進行檢測，結果表明，檢測特異性高、靈敏度強，廢水和雞蛋中的LOD均為102CFU/mL，牛奶和果汁中的LOD為103CFU/mL，檢測用時為1 h左右[50]。

HDA-微流控檢測的引物設計簡單、靈敏度高、特異性強，對樣品純度要求較低，但是HDA體系中所需酶試劑的價格較為昂貴，是該技術應用過程中的限制因素。

3 結 語

雖然目前以核酸為基礎的食品病原微生物檢測方法已經(jīng)成熟，但是操作過程依賴于大型設備和熟練操作人員，導致測試耗時長、成本昂貴，且不便于現(xiàn)場應用。核酸-微流控將檢測全過程集中在一塊芯片中，實現(xiàn)了自動化，并具有微型化帶來的便攜性和低成本的優(yōu)勢，結合靈活的設計可以進一步實現(xiàn)高通量檢測，具有取代傳統(tǒng)檢測的潛力。但將核酸-微流控芯片實際應用于食品病原微生物檢測仍然存在一些挑戰(zhàn)，例如食品的基質比較復雜，需要前處理；檢測中所有關鍵步驟需高效集成在單個微流控芯片；微流控芯片中的反應體系體積小，對傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性要求更高。目前，許多策略如重力、電、磁、聲學、親和化學和流體力學等已經(jīng)用于解決核酸-微流控芯片檢測食品病原微生物過程中存在的問題，這一領域的研究仍處于起步階段，需要付出更多努力來促進食品病原微生物檢測的發(fā)展。