陳焰 王崗玲 吳海明

1武警福建省總隊醫(yī)院感染科（福州350003）；2廈門市兒童醫(yī)院檢驗科（福建廈門361000）

小鼠患上內(nèi)毒素血癥和嚴(yán)重的多菌性腹膜炎后，炎癥性中性粒細(xì)胞中整聯(lián)蛋白VLA-3（CD49c/CD29）水平上升，而以VLA-3高中性粒細(xì)胞亞群為目標(biāo)進(jìn)行治療可提高小鼠的存活率［1-2］。中性粒細(xì)胞通過吞噬作用在宿主防御系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。感染引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)后，中性粒細(xì)胞由于促炎性細(xì)胞因子和微生物成分的激活導(dǎo)致凋亡減少、趨化性改變以及內(nèi)臟器官過度浸潤，從而導(dǎo)致附帶組織損傷［4］。整聯(lián)蛋白是異二聚體跨膜蛋白，可介導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白間的粘附和信號傳導(dǎo)，并促進(jìn)其在血管內(nèi)和間質(zhì)的遷移［5］?；罨鞍證是一種維生素K依賴的絲氨酸蛋白酶，有很強(qiáng)的抗凝功能，源自凝血酶介導(dǎo)的循環(huán)蛋白C裂解［6］。除了其天然的抗凝功能外，活化蛋白C還有細(xì)胞保護(hù)和抗炎活性，包括保護(hù)內(nèi)皮屏障、抑制細(xì)胞凋亡、減少促炎性介質(zhì)的分泌和抑制白細(xì)胞遷移［7］。本研究使用人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞探究活化蛋白C與VLA-3的靶向關(guān)系及其對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制和對線粒體功能保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（Sigma）在補(bǔ)充10%熱滅活胎牛血清（FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素（100 U/mL）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)，5%CO2和潮濕空氣中恒溫37 ℃加熱。

1.2 BEAS-2B 細(xì)胞結(jié)核桿菌感染及細(xì)胞轉(zhuǎn)染將BEAS-2B細(xì)胞以5×104個/cm2的密度接種在培養(yǎng)板上。用50個細(xì)菌/細(xì)胞的結(jié)合桿菌感染培養(yǎng)物。將感染的培養(yǎng)物孵育各種時間，直至72 h。與BCG孵育后，將BAEpC用PBS洗滌3次。通過Lipofectamine 2000試劑將重組慢病毒載體質(zhì)粒pLP與BEAS-2B細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，并在37 ℃下孵育48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液以獲得攜帶活化蛋白C基因或空載體慢病毒溶液的慢病毒。將BEAS-2B細(xì)胞（5 ×103）接種到96孔板中并在37 ℃下培養(yǎng)過夜直至細(xì)胞融合率為50% ～60%。加入攜帶活化蛋白C基因的慢病毒pLP［感染復(fù)數(shù)（MOI）=4］并在37 ℃下孵育24 h。第2天，棄去含有病毒的培養(yǎng)基并用DMEM+10%小牛血清培養(yǎng)基代替，連續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 實驗分組BEAS-2B細(xì)胞分為3組：BEAS-2B組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞系作為實驗對照），結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組（將BEAS-2B以5×104細(xì)胞/cm2的密度接種在培養(yǎng)板上，用50個細(xì)菌/細(xì)胞的結(jié)合桿菌感染培養(yǎng)物），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組（攜帶活化蛋白C的慢病毒載體與BEAS-2B進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，讓其超表達(dá)）。

1.4 整聯(lián)蛋白配體結(jié)合測定使用純化的可溶性人α3β1、α5β1和αVβ3進(jìn)行可溶性整聯(lián)蛋白結(jié)合測定。將1 μg/mL的可溶性整聯(lián)蛋白與針對β1或β3亞基的單克隆抗體（針對β1整聯(lián)蛋白的mAb TS2/6和針對β3整聯(lián)蛋白的mAb D3）加上rhAPC混合在室溫下在L15培養(yǎng)基中將1 mmol/L Mn2+在室溫下放置1 h，用A/G蛋白沉淀蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)行SDS-PAGE和大鼠抗人活化蛋白C抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。對于活化蛋白C結(jié)合抑制測定，從健康供體中分離中性粒細(xì)胞，與0、0.1、1和10 μg活化蛋白C以及針對整聯(lián)蛋白α3、α5、αv或αM的封閉抗體一起孵育在1 mL L15培養(yǎng)基中于4 ℃放置30 min。洗滌后，將細(xì)胞在室溫下用3.7%甲醛固定10 min。固定后，將細(xì)胞用大鼠抗活化蛋白C一抗和PE標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗在黑暗中于4 ℃染色30 min，洗滌并重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）用于流式細(xì)胞儀分析。樣品均在FACS Calliber流式細(xì)胞儀上收集，使用Flow Jo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）使用試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反應(yīng)在42 ℃下進(jìn)行60 min，通過加熱至70 ℃5 min而終止。使用SYBR? Green PCR Master mix和ABI Prism 7500序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行qPCR。PCR熱循環(huán)條件為：在94 ℃下預(yù)變性3 min；進(jìn)行35個94 ℃持續(xù)50 s，37 ℃1 min，72 ℃1.5 min的循環(huán)；在72 ℃延伸7 min。使用2-ΔΔCq方法對mRNA水平進(jìn)行定量，并標(biāo)準(zhǔn)化為對照。RTqPCR用于確定IL-6、IL-8、MCP-1在細(xì)胞中的表達(dá)。見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.6 線粒體復(fù)合物活性檢測使用熒光探針JC-1評估線粒體功能，該探針在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生綠色熒光，并在呼吸性線粒體中聚集時產(chǎn)生紅色/橙色熒光。在培養(yǎng)基中將細(xì)胞與2 μg/mL JC-1孵育30 min，用培養(yǎng)基洗滌一次。使用熒光平板讀數(shù)器進(jìn)行熒光測量，對J聚集體使用530 nm激發(fā)/590 nm發(fā)射設(shè)置（紅色/橙色熒光）和485 nm激發(fā)/530-胞質(zhì)熒光的nm發(fā)射設(shè)置（綠色）。使用配備了雙羅丹明/熒光素濾光片組，×40水浸物鏡和數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)（診斷儀器）的Zeiss Axiophot 2熒光顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。

1.7 線粒體膜電位測量在5 μmol/L Pim1抑制劑K00135（22）或DMSO存在下，將融合了血清的枯竭BEAS-2B細(xì)胞層與0、10%、15%、20%、30%或40%CSE孵育4 h。將細(xì)胞用RPMI 1640洗滌兩次，用500 nmol/L TMRE染色，在37 ℃下染色30 min。染色后，將細(xì)胞用RPMI 1640洗滌一次，用胰蛋白酶消化，收集在FACS管中。將細(xì)胞重懸于300 μL補(bǔ)充鈣、鎂、葡萄糖和丙酮酸的無色DPBS中測量線粒體膜電位（Ψm）。使用Winlist軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 ELISA 和TUNEL 鑒定細(xì)胞凋亡及活力通過細(xì)胞死亡ELISA和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記（TUNEL）檢測BAEpC凋亡。使用細(xì)胞死亡ELISA試劑盒根據(jù)制造商的規(guī)程檢測細(xì)胞質(zhì)組蛋白相關(guān)的DNA片段。將細(xì)胞（5 × 104）接種在24孔板中，在37 ℃下孵育16 h。將細(xì)胞用200 μL裂解緩沖液在25 ℃裂解30 min，將20 μL上清液轉(zhuǎn)移至鏈霉親和素包被的多板中；將包含4 μL抗組蛋白-生物素和4 μL抗DNA-POD的80 μL免疫試劑添加到每個孔中，并將板在室溫下振搖2 h，以檢測細(xì)胞裂解物中的單核糖體和寡核糖體。洗滌后，將孔與100 μL的2，2′-疊氮基-二（3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽）（ABTS）溶液在室溫下孵育20 min。立即在酶標(biāo)儀中于405 nm（波長540 nm）讀取吸光度。用BCG處理后，將BEAS細(xì)胞在PBS（pH 7.4）中的1%多聚甲醛中在冰上固定1 h，洗滌，在70%乙醇中于-20 °C儲存至少24 h。將樣品與含有TdT酶和Br-dUTP的反應(yīng)緩沖液在37 °C孵育1 h，與FITC標(biāo)記的抗BrdU在37°C孵育30 min以進(jìn)行FASCan分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較用χ2分析；P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活化蛋白C 與整聯(lián)蛋白VLA-3 結(jié)合測定VLA-3較VLA-3和αVβ3結(jié)合程度升高（P ＜0.05）。與其他兩種整聯(lián)蛋白相比，VLA-3對活化蛋白C的親和力更高。見圖1、表2。

圖1 可溶性VLA-3、VLA-5 和αVβ3與APC 的結(jié)合測定Fig.1 Determination of binding of soluble vla-3，VLA-5 and αVβ3 with APC

表2 活化蛋白C 與VLA-3 的親和度檢測Tab.2 Detection of affinity between activated protein C and vla-3 ±s

表2 活化蛋白C 與VLA-3 的親和度檢測Tab.2 Detection of affinity between activated protein C and vla-3 ±s

組別VLA-3 VLA-5 αVβ3 F 值P 值活化蛋白C 濃度5（μg/mL）12.65±2.17 2.36±0.54 3.41±1.06 15.327 0.001活化蛋白C 濃度10（μg/mL）23.84±3.16 5.37±1.22 7.39±2.04 19.157 0.001

2.2 活化蛋白C 減輕結(jié)合桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達(dá)升高（P ＜0.05），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達(dá)降低（P ＜0.05），APC降低了結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。見圖2、表3。

圖2 qRT-PCR 檢測促炎因子mRNA 表達(dá)Fig.2 The expression of proinflammatory factor mRNA was detected by QRT PCR

表3 細(xì)胞促炎因子mRNA 表達(dá)Tab.3 Expression of proinflammatory factor mRNA ±s

表3 細(xì)胞促炎因子mRNA 表達(dá)Tab.3 Expression of proinflammatory factor mRNA ±s

組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值IL-6 1.15±0.23 2.24±0.36 1.23±0.27 15.652 0.001 IL-8 0.97±0.12 1.88±0.24 1.07±0.15 12.427 0.001 MCP-1 0.75±0.05 2.04±0.38 1.35±0.26 12.524 0.001

2.3 細(xì)胞線粒體復(fù)合物活性檢測BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅳ活性升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅳ活性降低（P ＜0.05）。見表4。

表4 線粒體復(fù)合物活性檢測Tab.4 Detection of mitochondrial complex activity ±s

表4 線粒體復(fù)合物活性檢測Tab.4 Detection of mitochondrial complex activity ±s

組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值線粒體復(fù)合物Ⅰ（AU/50 μg MITO）15.64±3.24 4.28±1.32 16.57±3.18 20.285 0.001線粒體復(fù)合物Ⅳ（AU/10 μg MITO）17.58±2.28 8.61±1.16 14.81±1.50 11.491 0.001

2.4 細(xì)胞線粒體膜電位評估BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組膜電位升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組膜電位降低（P ＜0.05）。結(jié)核桿菌誘導(dǎo)了細(xì)胞的線粒體功能受損，活化蛋白C的超表達(dá)抑制了線粒體受損情況。見表5。

表5 線粒體復(fù)合物活性檢測Tab.5 Detection of mitochondrial complex activity±s

表5 線粒體復(fù)合物活性檢測Tab.5 Detection of mitochondrial complex activity±s

組別 膜電位×103 BEAS-2B 組9.52±0.42結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值7.43±0.19 8.74±0.23 9.151 0.001

2.5 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力檢測BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率降低（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率升高（P ＜0.05）。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組細(xì)胞活力升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞細(xì)胞活力降低（P ＜0.05）。TUNEL染色檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組的陽性率較BEAS-2B組高（P ＜0.05），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組減少了TUNEL染色陽性率（P ＜0.05）。見圖3、表6。

表6 細(xì)胞凋亡率、活力情況檢測Tab.6 Detection of apoptosis rate and vitality±s

表6 細(xì)胞凋亡率、活力情況檢測Tab.6 Detection of apoptosis rate and vitality±s

細(xì)胞凋亡（%） 細(xì)胞活力（%）組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值18.34±2.17 46.35±3.36 25.47±6.19 19.158 0.001 71.68±8.14 42.15±2.96 68.35±6.04 25.658 0.001

3 討論

活化蛋白C活化后有許多不同的生物學(xué)活性，包括抗血栓形成作用以及各種抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用，其最終作用是維持脈管系統(tǒng)的完整性［8］。雖然活化蛋白的抗凋亡和內(nèi)皮屏障功能需要激活內(nèi)皮蛋白C受體（endothelin C receptor，EPCR）和依賴性蛋白酶激活受體1（dependent protease activated receptor 1，PAR-1），但其抗炎作用是由EPCR-PAR-1依賴性和獨立途徑，可能涉及細(xì)胞粘附受體［9］。EPCR是在內(nèi)皮細(xì)胞上鑒定出的第一個活化蛋白C受體?；罨鞍證的抗凋亡和血管保護(hù)作用由EPCR參與和APC-EPCR復(fù)合體對G蛋白偶聯(lián)的PAR-1的次級激活介導(dǎo)［10］。許多表達(dá)EPCR的細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)VLA-3。

圖3 細(xì)胞TUNEL 染色檢測Fig.3 TUNEL staining of cells

本研究發(fā)現(xiàn)BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率降低，結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率升高。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組細(xì)胞活力升高，結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞細(xì)胞活力降低。凋亡過程非常耗能，并且依賴于ATP來執(zhí)行凋亡程序。結(jié)核桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，并且可阻止ATP的生成，從而通過釋放促炎性細(xì)胞因子和隨后募集嗜中性白細(xì)胞來激活先天免疫應(yīng)答。結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達(dá)升高，BEAS-2B轉(zhuǎn)染組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達(dá)降低，APC降低了結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時對相應(yīng)的細(xì)胞線粒體功能和線粒體膜電位進(jìn)行檢測，評估細(xì)胞炎癥反應(yīng)對線粒體的損傷程度，檢測各組細(xì)胞線體線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅳ活性受損情況發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅳ活性升高，結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅳ活性降低。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組膜電位升高，結(jié)核桿菌誘導(dǎo)組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組膜電位降低。結(jié)核桿菌誘導(dǎo)了細(xì)胞的線粒體功能受損，活化蛋白C的超表達(dá)抑制了線粒體受損情況。筆者分析發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)活化蛋白C的受體，暴露于人類重組活化蛋白C會抑制嗜中性粒細(xì)胞的趨化性［11］。在白細(xì)胞整合素中，VLA-3（α3β1；CD49c/CD29）是一種新型的高親和力細(xì)胞，它是嚴(yán)重系統(tǒng)性炎癥期間出現(xiàn)的高炎癥性嗜中性白細(xì)胞亞群的獨特細(xì)胞表面標(biāo)記rhAPC的受體［12］。在小鼠內(nèi)毒素血癥嚴(yán)重期間，嗜中性白血球表面上整合素VLA-3（CD49c/CD29）上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，將濃度不同的活化蛋白C與等量的活化的可溶性VLA-3，VLA-5和αVβ3整聯(lián)蛋白孵育。VLA-3較VLA-3和αVβ3結(jié)合程度升高。與其他兩種整聯(lián)蛋白相比，VLA-3對活化蛋白C的親和力更高?；罨鞍證通過整合素VLA-3（CD49c/CD29）以比其他RGD結(jié)合整合素有更高的親和力?；罨鞍證和整聯(lián)蛋白間的相互作用抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，暴露于結(jié)核桿菌的BEAS-2B或長時間暴露會導(dǎo)致壞死細(xì)胞死亡。

綜上所述，VLA-3是活化蛋白C的新型細(xì)胞受體，活化蛋白C可靶向作用VLA3中性粒細(xì)胞亞群降低人高炎癥反應(yīng)，提高線粒體復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅳ活性，有效抑制結(jié)合桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位下降。