楊凌博 楊金輝 魯帥奇 李小輝 盧績

1鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科（河南洛陽471009）；2吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科（長春130021）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，前列腺癌的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅男性健康［1］。早期前列腺癌的治療方式是根治性手術(shù)，治療效果較好［2］。但由于早期前列腺癌多無明顯癥狀，導(dǎo)致多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期前列腺癌［3］。探究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，可能對(duì)前列腺癌的早期診斷和分子靶向治療具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）存在于真核細(xì)胞，長度大于200個(gè)核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)［4］。在人類幾乎所有惡性腫瘤中存在lncRNA的異常表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)行為相關(guān)［5］。前列腺癌中存在lncRNA的異常表達(dá)，通過檢測前列腺癌組織或患者血清lncRNA的表達(dá)可能有助于前列腺癌的早期診斷［6］。ZNF571-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，可能參與急性髓細(xì)胞性白血病的發(fā)生、發(fā)展［7］。ZNF571-AS1在前列腺癌組織中的表達(dá)和分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬分析ZNF571-AS1在前列腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，觀察ZNF571-AS1對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本52例前列腺癌組織及癌旁組織均取自2018年3月至2019年5月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科住院患者。所有組織標(biāo)本均經(jīng)兩名以上病理學(xué)專家確診，所有患者術(shù)前均未接受過放療和化療?；颊吣挲g平均（59.43±14.63）歲。Gleason評(píng)分：＜7分27例，7分25例。臨床分期：Ⅰ和Ⅱ期33例，Ⅲ和Ⅳ期19例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）和前列腺癌細(xì)胞系（DU-145、C4-2B、LNCaP、PC-3）購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。qPCR試劑盒購于南京建成生物工程研究所。沉默ZNF571-AS1基因的質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒購于上海吉瑪基因股份有限公司。Matrigel基質(zhì)膠、一抗和二抗購于美國BD公司。培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000購于美國Invitrogen公司。Transwell小室購于美國Corning公司。噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，正常前列腺上皮細(xì)胞用含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的DU-145細(xì)胞采用LipofectamineTM 3000試劑轉(zhuǎn)染沉默ZNF571-AS1基因的質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，命名為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 qPCR 檢測ZNF571-AS1、miR-301b-3p 和AR mRNA 的表達(dá)TRIzol法提取組織及細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。建立qPCR反應(yīng)體系，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測ZNF571-AS1和AR mRNA的表達(dá)；以U6作為內(nèi)參，檢測miR-301b-3p的表達(dá)。引物序列如下，ZNF571-AS1正向引物：GGTCTCGGTACATGCGTGGA，反向引物：TGGCAGTATAACAGGCTCCC；miR-301b-3p正 向 引 物：GGGCTTTGACAATATCATTG，反向引物：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；GAPDH正向引物：CTGGGCTACACTGAGCACC，反向引物：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG；AR正向引物：CCAGGGACCATGTTTTGCC，反向引物：CGAAGACGACAAGATGGACAA。U6正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT 法檢測DU-145 細(xì)胞的增殖能力收集兩組細(xì)胞，分別以3 × 103個(gè)/孔接種于96孔板。檢測時(shí)每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加150 μL/孔二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定每孔450 nm波長處的光密度（OD）值，分別檢測第1、2、3、4、5天細(xì)胞的增殖活性。

1.2.4 小室（Transwell）實(shí)驗(yàn)檢測DU-145 細(xì)胞的侵襲能力采用培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，按50 μL每孔包被小室底膜上室。收集兩組細(xì)胞，分別以3 × 104個(gè)/孔接種于上室，下室加入600 μL含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棉簽擦去未侵襲的細(xì)胞，采用多聚甲醛固定，采用0.1%結(jié)晶紫染液染色，PBS溶液沖洗。在100倍顯微鏡下每孔隨機(jī)取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測ZNF571-AS1 的分子機(jī)制采用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0預(yù)測ZNF571-AS1可互補(bǔ)結(jié)合的miRNA。采用生物信息學(xué)網(wǎng)站RNAhybrid預(yù)測miR-301b-3p可互補(bǔ)結(jié)合的靶基因mRNA。

1.2.6 Western blot法檢測AR蛋白和PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)收集兩組細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度。采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉。采用一抗孵育，在4 ℃下過夜。洗膜后，采用二抗在室溫下孵育。洗膜后，采用ECL法發(fā)光、顯影。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和癌旁組織中ZNF571-AS1 的表達(dá)前列腺癌組織和癌旁組織中ZNF571-AS1的表達(dá)分別為（5.71 ± 0.61）和（0.69 ± 0.18），前列腺癌組織中ZNF571-AS1表達(dá)顯著高于癌旁組織（P ＜0.01），見圖1。

圖1 前列腺癌組織和癌旁組織中ZNF571-AS1 的表達(dá)Fig.1 ZNF571-AS1 expression in prostate cancer tissues and adjacent tissues

2.2 前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中ZNF571-AS1的表達(dá)與正常前列腺上皮細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞系中ZNF571-AS1的表達(dá)顯著較高（P ＜0.05），DU-145細(xì)胞中ZNF571-AS1的表達(dá)最高（P ＜0.01），因而選擇DU-145細(xì)胞進(jìn)行研究。見圖2。

圖2 前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中ZNF571-AS1 的表達(dá)Fig.2 ZNF571-AS1 expression in prostate cancer cells and normal prostate epithelial cells

2.3 兩組DU-145 細(xì)胞中ZNF571-AS1 的表達(dá)qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DU-145細(xì)胞中ZNF571-AS1表達(dá)分別為（0.17 ± 0.04）和（1.01 ±0.06），實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組（P ＜0.01），提示轉(zhuǎn)染成功。

2.4 低表達(dá)ZNF571-AS1抑制DU-145細(xì)胞的增殖能力MTT法結(jié)果顯示，從 第2天起，實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 MTT 檢測ZNF571-AS1 對(duì)DU-145 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 MTT was used to detect the effect of ZNF571-AS1 on the proliferation ability of DU-145 cells

2.5 低表達(dá)ZNF571-AS1 抑制DU-145 細(xì)胞的侵襲能力小室（Transwell）實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DU-145細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（33.37±5.33）個(gè)和（87.55±6.72）個(gè)，與對(duì)照組相比，低表達(dá)ZNF571-AS1后顯著抑制DU-145細(xì)胞的侵襲能力（P ＜0.01），見圖4。

2.6 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測ZNF571-AS1 的分子機(jī)制采用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0預(yù)測ZNF571-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-301b-3p。采用生物信息學(xué)網(wǎng)站RNAhybrid預(yù)測miR-301b-3p可互補(bǔ)結(jié)合AR mRNA。見圖5。

2.7 低表達(dá)ZNF571-AS1 的前列腺癌細(xì)胞中miR-301b-3p 和AR mRNA 的表達(dá)qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DU-145細(xì)胞miR-301b-3p的表達(dá)分別為（5.28±0.49）和（1.08±0.40），低表達(dá)ZNF571-AS1可促進(jìn)miR-301b-3p的表達(dá)（P ＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DU-145細(xì)胞AR mRNA的表達(dá)分別為（0.38 ± 0.05）和（1.01 ± 0.06），提示miR-301b-3p表達(dá)增加后，AR mRNA表達(dá)降低（P ＜0.01）。

2.8 低表達(dá)ZNF571-AS1促進(jìn)AR蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示低表達(dá)ZNF571-AS1引起AR蛋白表達(dá)升高，AR蛋白表達(dá)升高后，造成PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白如p-PI3K、p-Akt及p-GSK3β蛋白表達(dá)降低，PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。見圖6。

圖4 小室（Transwell）實(shí)驗(yàn)檢測ZNF571-AS1 對(duì)DU-145 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Transwell invasion test was used to detect the effect of ZNF571-AS1 on the invasion ability of DU-145 cells

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測ZNF571-AS1 的分子機(jī)制Fig.5 Bioinformatics technology predicted the molecular mechanism of ZNF571-AS1

圖6 Western blot 法檢測AR 蛋白及PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況Fig.6 Western blot method was used to detect the expression of AR protein and PI3K/Akt signaling pathway proteins

3 討論

lncRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，缺乏開放閱讀框［8］。lncRNA可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與包括前列腺癌在內(nèi)的各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9］。越 來 越 多 的lncRNA如MNX1-AS1［10］、GAS5［11］、PCAT1［12］、CCAT1［13］、LINC01638［14］等被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中異常表達(dá)，影響前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。ZNF571-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，有研究［7］表明，ZNF571-AS1可能發(fā)揮癌基因作用，促進(jìn)急性髓細(xì)胞性白血病的發(fā)生、發(fā)展。ZNF571-AS1在前列腺癌中的表達(dá)和功能尚不明確。本研究中，ZNF571-AS1在前列腺癌組織和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，表明其可能在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮癌基因作用。MTT實(shí)驗(yàn)和小室實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)ZNF571-AS1可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)一步證明ZNF571-AS1在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用。

lncRNA攜帶有特定miRNA的“種子序列”，可吸附結(jié)合miRNA，阻止miRNA與其靶基因mRNA結(jié)合，從而抑制miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的干擾作用［15］。本研究采用starBase v2.0網(wǎng)站預(yù)測，ZNF571-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-301b-3p。miR-301b-3p可能在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，上調(diào)miR-301b-3p具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ZNF571-AS1后，前列腺癌細(xì)胞中miR-301b-3p表達(dá)增加，提示ZNF571-AS1可能通過吸附結(jié)合miR-301b-3p。miRNA主要通過結(jié)合靶基因mRNA區(qū)域，抑制其翻譯或者直接導(dǎo)致其降解，從而抑制靶基因的表達(dá)［17］。本研究采用RNAhybrid網(wǎng)站預(yù)測，miR-301b-3p可互補(bǔ)結(jié)合雄激素受體（Androgen receptor，AR）mRNA。AR屬于類固醇激素受體家族，定位于Xq11-12［18-19］。AR在前列腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯增加，與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)［20］。下調(diào)AR表達(dá)可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-301b-3p表達(dá)增加后，前列腺癌細(xì)胞中AR基因表達(dá)下調(diào)，提示miR-301b-3p可能具有抑制AR基因表達(dá)的作用。有研究［22］表明，AR通過促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。本研究證明，AR基因表達(dá)降低后，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白如p-PI3K、p-Akt及p-GSK3β表達(dá)明顯降低，表明PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被干擾。本研究下一步將通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ZNF571-AS1與miR-301b-3p及miR-301b-3p與AR mRNA之間的結(jié)合。

綜上所述，lncRNA ZNF571-AS1在前列腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)ZNF571-AS1可能通過調(diào)控miR-301b-3p/AR信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此，ZNF571-AS1在前列腺癌分子靶向治療中具有一定的研究價(jià)值。