張芳雍 譚國(guó)鉗 曾裕文 吳帆

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院肝膽外科（廣州510220）

Mus81（甲磺酸鹽及紫外線敏感性81號(hào)基因）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種DNA修復(fù)基因，在維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［1-2］，因而曾被認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制基因［3］。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，Mus81的生物學(xué)功能具有多樣性，也可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用［4］。YIN等［5］研究就發(fā)現(xiàn)Mus81可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的遷移。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，Mus81沉默可逆轉(zhuǎn)人肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的化療耐藥性［6-7］，并可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的增殖、促進(jìn)其凋亡［8］，提示Mus81可能是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，但Mus81在人肝癌細(xì)胞系增殖凋亡中的作用尚未明確。為此，本研究以慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA（siRNA）沉默人肝癌細(xì)胞系Hep3B中Mus81基因的表達(dá)，觀察Mus81對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料Hep3B肝癌細(xì)胞系、siRNA慢病毒載體GV248、293T細(xì)胞、包裝質(zhì)粒pGC-LV、pHelper1.0和pHelper2.0均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司（TP800）；MTT試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Giemsa染液購(gòu)自美國(guó)chemicon公司；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司；碘化丙錠（PI）染色試劑盒購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

1.2 慢病毒介導(dǎo)的siRNA設(shè)計(jì)針對(duì)Mus81基因的短發(fā)卡RNA（shRNA）序列如下（由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成）：正義鏈：5′-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGAT -CCAGTACCAACTCTTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3′；陰性對(duì)照序列為：正義鏈：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTTCTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。將上述shRNA序列形成的DNA雙鏈與siRNA慢病毒質(zhì)粒GV248連接，再利用Lipofectamine 2000將上述質(zhì)粒分別與pGC-LV、pHelper1.0和pHelper 2.0慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，生成Mus81-siRNA和及陰性對(duì)照慢病毒。將感染上述2種慢病毒的肝癌Hep3B細(xì)胞系分別命名為Mus81-siRNA組（實(shí)驗(yàn)組）和siRNA-NC組細(xì)胞（陰性對(duì)照組）。感染3 d后采用熒光倒置顯微鏡（micropublisher 3.3RTV，日本奧林帕斯公司）觀察兩組細(xì)胞的慢病毒感染效率。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)Mus81 基因干擾效率根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書提取Mus81-siRNA組和siRNA-NC組細(xì)胞的總RNA，在熒光定量PCR儀行PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。Mus81基因引物：上游引物：5′-CTACAGCACTTCGGAGACG-3′；下游引物：5′-GGTAGAGCACCAGCAGTATCA-3′。內(nèi)參管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物：上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。采用2-ΔΔCT法分析Mus81基因表達(dá)水平。

1.4 MTT檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Mus81-siRNA組和siRNA-NC組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸成細(xì)胞懸液，以2 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。鋪板后置37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于第2天開始每孔加入10 μL的MTT（5 mg/mL），無需換液。于檢測(cè)前4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸光度（OD）值，繪制兩組Hep3B細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞克隆形成檢測(cè)兩組細(xì)胞以800個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將接種細(xì)胞培養(yǎng)到14 d，中途每隔3 d進(jìn)行換液。實(shí)驗(yàn)終止時(shí)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞1次后每孔加入1 mL多聚甲醛，固定細(xì)胞30 ～60 min，PBS再次洗滌后加入GIEMS染液500 μL，染色20 min。ddH2O洗細(xì)胞至洗凈板上背景，克隆計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)取兩組細(xì)胞于5 mL離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，以1×binding buffer洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。以1 × staining buffer重懸細(xì)胞后取細(xì)胞懸液100 μL（1 × 105細(xì)胞），加入5 μL annexin V-APC染色，室溫避光10 ～15 min，轉(zhuǎn)移至流式上機(jī)管中行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè)收集兩組細(xì)胞于5 mL離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞于4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞2 h。以1 500 r/min離心5 min去固定液，PBS洗滌細(xì)胞沉淀一次，加入PI染色液重懸細(xì)胞沉淀，上機(jī)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student′s t檢驗(yàn)。生長(zhǎng)曲線采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。所有分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mus81 干擾效率熒光顯微鏡下觀察Mus81-siRNA和siRNA-NC兩組細(xì)胞慢病毒感染效率均高于80%。qRT-PCR檢測(cè)Mus81沉默后Hep3B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Mus81-siRNA組Mus81基因的表達(dá)水平僅為siRNA-NC組的23.58%［（0.236 ± 0.008）vs.（1.001± 0.059），t = 14.977，P ＜0.001］，即Mus81基因干擾效率為76.42%，見圖1。

2.2 Mus81 沉默對(duì)Hep3B 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT法繪制出的生長(zhǎng)曲線提示Mus81-siRNA組的生長(zhǎng)速度明顯低于siRNA-NC組（F=2 056.758，P ＜0.001），見圖2。

2.3 Mus81 沉默對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖能力的影響平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，Mus81-siRNA組Hep3B細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯少于siRNA-NC組［（2±1）vs.（54±3），t=29.133，P ＜0.001］，見圖3。

圖1 慢病毒感染Hep3B 細(xì)胞的感染效率及干擾效率Fig.1 Infection efficiency and interference efficiency of lentivirus infected Hep3B cells

圖2 MTT 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of MTT test

2.4 Mus81 沉默對(duì)Hep3B 細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，Mus81-siRNA組Hep3B細(xì)胞的凋亡率是siRNA-NC組細(xì)胞的30.25倍［（20.87 ±0.82）%vs.（0.69±0.09）%，t=-42.543，P ＜0.001］，見圖4。

2.5 Mus81沉默對(duì)Hep3B細(xì)胞周期的影響Mus81-siRNA組細(xì)胞的G1、S和G2/M期細(xì)胞比例分別為（33.77±1.61）%、（36.96±3.09）%和（29.27±2.64）%，siRNA-NC組分別為（42.06±0.40）%、（33.84±0.88）%和（24.10 ± 0.50）%。Mus81-siRNA組G1期細(xì)胞比例低于siRNA-NC組（t = 8.657，P ＜0.05），而兩組間S和G2/M期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05］，見圖5。

3 討論

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of plate clone formation experiment

圖4 Annexin V-APC 染色法檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of Annexin V-APC staining method

圖5 細(xì)胞周期分布結(jié)果Fig.5 Results of cell cycle distribution

肝癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，高居我國(guó)惡性腫瘤病死率的第二位［9］。盡管肝癌的手術(shù)治療及靶向藥物等取得了很大的進(jìn)步，但其長(zhǎng)期存活率仍不能令人滿意［11-12］。而篩選潛在的肝癌治療靶點(diǎn)可能是提高肝癌治療療效、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵［13-14］。許多研究表明，DNA修復(fù)基因與肝癌的易感性和預(yù)后密切相關(guān)［15］，而靶向抑制這些DNA修復(fù)基因可作為肝癌的潛在治療策略［16-17］。Mus81是定位于人11號(hào)染色體長(zhǎng)臂的DNA修復(fù)基因，屬于核酸內(nèi)切酶超家族，在同源重組修復(fù)和非同源末端鏈接過程中發(fā)揮極其重要的作用。MCPHERSON等［3］發(fā)現(xiàn)Mus81基因敲除的小鼠中可自發(fā)淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤，據(jù)此曾認(rèn)為Mus81是一個(gè)腫瘤抑制基因。但YIN等［5］新近的研究結(jié)果顯示Mus81可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。而吳云路等［18］的研究則發(fā)現(xiàn)Mus81過表達(dá)可抑制SKBR3乳腺癌細(xì)胞系的增殖能力并降低該細(xì)胞系的侵襲遷移能力。筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)Mus81基因沉默后可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡［8］，且敲減Mus81基因可逆轉(zhuǎn)人肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的化療耐藥性［6-7］，提示其是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。上述研究提示Mus81在惡性腫瘤中的作用存在多樣性和差異性，在部分腫瘤中發(fā)揮著促癌作用，但其在肝癌增殖凋亡中的作用尚未明確［19］，還有待于進(jìn)一步研究。

本研究首先采用慢病毒介導(dǎo)的siRNA構(gòu)建沉默Mus81的Hep3B人肝癌細(xì)胞系，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示Mus81敲減慢病毒的細(xì)胞感染效率高于80%，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Mus81基因干擾效率高達(dá)76.42%，提示該慢病毒感染和敲減Mus81的效果均很理想，Mus81基因敲減的Hep3B肝癌細(xì)胞系已構(gòu)建成功。為進(jìn)一步研究Mus81沉默對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，采用MTT法對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Mus81-siRNA組的生長(zhǎng)速度明顯低于siRNA-NC組，且Mus81-siRNA組細(xì)胞的增殖倍數(shù)在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上均低于siRNA-NC組，提示Mus81基因沉默抑制了Hep3B肝癌細(xì)胞系的增殖，這與筆者前期研究在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系中得到的結(jié)果相一致［8］，提示Mus81確實(shí)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但最近YIN等［5］的研究則發(fā)現(xiàn)Mus81沉默對(duì)SGC7901和BGC823胃癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)沒有明顯的影響，提示Mus81沉默對(duì)不同的惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有不同的影響，推測(cè)這可能與Mus81在不同惡性腫瘤中的功能存在差異性有關(guān)，就如同目前的研究發(fā)現(xiàn)Mus81可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移卻抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移一樣［5，18］，但這尚待進(jìn)一步研究。

為探索Mus81沉默抑制Hep3B肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Mus81敲減對(duì)Hep3B細(xì)胞增值能力和凋亡水平的影響，結(jié)果顯示Mus81-siRNA組細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯少于siRNA-NC組，僅為后者的3.70%，提示Mus81沉默可明顯抑制Hep3B肝癌細(xì)胞系的增殖能力，這可能也是Mus81沉默導(dǎo)致Hep3B肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降的原因之一。鑒于細(xì)胞周期的阻滯也可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度的降低，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了兩組Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示Mus81-siRNA組Hep3B細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例低于siRNANC組，而S和G2/M期細(xì)胞比例則無明顯差異，提示Mus81沉默可引起Hep3B肝癌細(xì)胞系G2/M期阻滯，這與既往研究中發(fā)現(xiàn)Mus81沉默可引起HCTll6結(jié)腸癌細(xì)胞系輕微G2/M期阻滯的結(jié)果一致［8］，不僅進(jìn)一步證明Mus81的確參與了G2/M期的調(diào)控，也提示Mus81沉默導(dǎo)致的G2/M期阻滯可能是其抑制Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)的原因之一。但考慮到Mus81沉默導(dǎo)致的G2/M期阻滯的程度并不足以解釋其對(duì)Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的抑制，我們也分析了Mus81沉默對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mus81-siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯高于siRNANC組，是后者的30.25倍，這與既往研究中HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞系和HCTll6結(jié)腸癌細(xì)胞系的結(jié)果一致［8，19］，顯示促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是Mus81沉默抑制Hep3B肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要原因。既往研究通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Mus81敲減組HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Mus81可能通過調(diào)控Bax、Bcl-2和p53等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［8］。STC2基因可在Mus81介導(dǎo)下調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡［19］。Mus81是否通過上述信號(hào)通路或其他信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞系增殖凋亡的調(diào)控目前尚不清楚，仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mus81基因沉默可明顯抑制Hep3B肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖并促進(jìn)其G2/M期阻滯及凋亡，提示Mus81是一個(gè)潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。