李廣明，劉嘉悅，張桂信，李詩潔，尚 東，陳海龍，楊玉龍

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科，大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116011；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院膽石病中心，上海 200120）

膽汁淀粉酶作為診斷膽胰系統(tǒng)疾病的重要指標(biāo)，是醫(yī)學(xué)共識(shí)。在膽胰匯合結(jié)構(gòu)異常、膽系癌變、膽囊結(jié)石、膽管結(jié)石、膽道梗阻都發(fā)生改變[1-3]。膽汁淀粉酶的測定及研究對臨床胰腺及相關(guān)膽道疾病的探究和臨床科研具有重大意義[4-5]。目前，雖然對膽汁淀粉酶的病理生理及臨床意義的研究有了相關(guān)的進(jìn)展，但仍缺少對樣本的運(yùn)輸和保存受時(shí)間、溫度與離心速度影響的研究。因此，本研究參照臨床血液樣本檢測的常見誤差問題[6]，探討保存時(shí)間以及離心速度對膽汁淀粉酶穩(wěn)定性的影響。這對膽汁淀粉酶測定結(jié)果準(zhǔn)確性及檢驗(yàn)質(zhì)量的提升具有重要作用，為臨床研究提供相關(guān)的理論依據(jù)。

膽汁中為α淀粉酶?，F(xiàn)階段測定α淀粉酶主要方法有3種，分別為碘-淀粉比色法、2氯4硝基苯酚麥芽三糖苷（CNPG3）和亞乙基-NP-麥芽糖庚苷法（EPSG7法）[7]。利用碘-淀粉比色法測定淀粉酶活力，我國檢驗(yàn)科應(yīng)用最廣泛。與其他淀粉酶測定方法相比，碘-淀粉比色法有簡、便、廉、驗(yàn)及準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)[8]。因此，本研究選擇碘-淀粉比色法來測定膽汁α淀粉酶。

材料與方法

一、一般資料

收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)治療膽總管結(jié)石病人共27例。移動(dòng)式C型臂X射線機(jī)引導(dǎo)導(dǎo)絲進(jìn)入膽管。造影管進(jìn)入膽管2 cm，抽取膽汁10 mL。膽汁抽取后即刻用低溫樣本轉(zhuǎn)移箱轉(zhuǎn)移至4℃冰箱儲(chǔ)存。所有樣本行淀粉酶檢測并記錄，以作對比。

二、儀器與試劑

采用BioTek公司的Cytation 3細(xì)胞成像多功能檢測儀（微孔板檢測儀，即酶標(biāo)儀）。試劑采用南京建成生物的α淀粉酶試劑盒，用碘-淀粉比色法測定膽汁α淀粉酶活力。另有離心管、六孔板、水浴鍋、旋渦混勻器、低速離心機(jī)。

三、方法

（一）樣本采集

病人保持俯臥位或左側(cè)臥位，導(dǎo)管經(jīng)口腔、食管、胃到達(dá)十二指腸降部，通過十二指腸乳頭插入至膽管內(nèi)。注射造影劑前在導(dǎo)管外側(cè)端連接注射器，抽取膽汁。

（二）樣本分組研究保存時(shí)間和離心速度

將待測樣本隨機(jī)抽取18例研究保存時(shí)間。每例樣本旋渦振蕩后，立即在20 min內(nèi)分裝6份樣本，即6組。其中一份在30 min內(nèi)檢測，其余5份放置于 4℃冰箱中分別存放 3 h、12 h、24 h、72 h和30 d。 6 組保存時(shí)間分別為 30 min、3 h、12 h、24 h、72 h和30 d，每組18例。

其余9例樣本，每份樣本分為3份即3組，第一組不離心，余兩組分別以3 000 r/min、8 000 r/min速度離心，10 min后取上清液。3組研究離心速度分別為3 000 r/min和8 000 r/min，每組9例。

（三）樣本檢測

用碘-淀粉比色法測定膽汁α淀粉酶活力。按試劑盒說明配制碘應(yīng)用液。取0.1 mL待測樣本與0.5 mL底物緩沖液混勻，37℃水浴7.5 min。后加入0.5 mL碘應(yīng)用液，加入3 mL雙蒸餾水?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀檢測660 nm處吸光值。每份樣本平行測3次，取平均值。利用公式計(jì)算α淀粉酶活力。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0?統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。淀粉酶檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各時(shí)間點(diǎn)的測量值與初始（30 min值）測量值比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。不同離心速度比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4℃保存膽汁α淀粉酶活力隨時(shí)間的變化

4℃保存3 h時(shí)，膽汁α淀粉酶活力下降幅度為0.73個(gè)百分點(diǎn)；保存12～72 h時(shí)，平均下降幅度約2.11個(gè)百分點(diǎn)；第30天時(shí)，下降幅度約3.94個(gè)百分點(diǎn)，P=0.33（＞0.05）。即膽汁中淀粉酶活力值雖有一定幅度的下降，但不超過5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在4℃條件下保存，30 d內(nèi)隨著存放時(shí)間的延長，膽汁α淀粉酶的穩(wěn)定性無明顯變化（見表1）。

表1 不同時(shí)間膽汁α淀粉酶活力（n=18）

二、膽汁α淀粉酶活力隨不同離心速度的變化

離心3 000 r/min后膽汁α淀粉酶活力較不離心下降2.70個(gè)百分點(diǎn)，8 000 r/min后下降8.98個(gè)百分點(diǎn)，離心8 000 r/min比離心3 000 r/min下降6.45個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05）?？赡苡捎?例膽汁樣本含有大量泥沙，離心后膽汁中部分雜質(zhì)沉淀導(dǎo)致上清液中膽汁α淀粉酶活力出現(xiàn)變化，具體原因分析擬通過進(jìn)一步大樣本量實(shí)驗(yàn)觀察，明確結(jié)論（見表2）。

由于出現(xiàn)一例膽汁的異常數(shù)據(jù)，剔除后每組8例的結(jié)果為，離心3 000 r/min后膽汁α淀粉酶較不離心下降0.16個(gè)百分點(diǎn)，P=0.869；離心8 000 r/min膽汁α淀粉酶較膽汁不離心上升4.74個(gè)百分點(diǎn)，P=0.885；離心8 000 r/min與離心3 000 r/min之間上升4.91個(gè)百分點(diǎn)，P=0.753。說明離心8 000 r/min之內(nèi)，膽汁淀粉酶的穩(wěn)定性無明顯改變（見表3）。

討 論

膽汁α淀粉酶主要來自于胰腺和唾液腺，但在特殊情況下，也可在扁桃體、子宮內(nèi)膜、肺、甲狀腺、輸卵管、前列腺內(nèi)存在并分泌[9]。正常生理狀態(tài)下，膽汁由膽鹽、膽色素、膽固醇、鈉、鉀等組成，不含淀粉酶，主要作用也僅是參與脂肪的消化與分解[1]。研究測定、分析膽汁淀粉酶有助于胰腺疾病和膽系疾病，尤其是膽系癌變疾病的診斷[10-12]。一般認(rèn)為，膽汁淀粉酶升高主要有以下兩方面原因：一方面，血清淀粉酶具有一定程度的熱不穩(wěn)定性，受到感染等影響，血清淀粉酶經(jīng)由肝臟的血液循環(huán)滲透至膽汁中，膽汁淀粉酶升高[13-15]；另一方面，膽胰管合流異常，胰液逆流入膽汁導(dǎo)致膽汁淀粉酶升高，而這也是膽汁淀粉酶升高的直接因素[16-19]。研究指出，膽胰反流存在于各種膽道疾病，包括急慢性膽管炎、膽管結(jié)石及膽管癌等良、惡性疾病[20-22]。

隨著內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)、經(jīng)皮經(jīng)肝膽管穿刺置管引流術(shù)等技術(shù)的不斷完善、發(fā)展，臨床收集膽汁越來越方便、快捷[23-24]。對膽汁淀粉酶的研究與分析逐漸深化，為臨床工作提供新的思路與方法。然而膽汁樣本淀粉酶的穩(wěn)定性對研究的最終結(jié)果起著重要甚至決定性影響，要求在儲(chǔ)存及檢測處理樣本時(shí)更嚴(yán)謹(jǐn)與科學(xué)。因此，本研究嚴(yán)格模擬膽汁樣本收集、儲(chǔ)存與檢測處理的相關(guān)狀態(tài)，控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保最后結(jié)果的準(zhǔn)確性，為相關(guān)研究者提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，樣本數(shù)據(jù)整體變化較小，分布較均勻。膽汁在4℃保存30 d內(nèi)，總體平均差異幅度≤3.94個(gè)百分點(diǎn)，膽汁α淀粉酶活力未出現(xiàn)明顯下降，t=1.01，P=0.33。隨著保存時(shí)間的延長，樣本穩(wěn)定性會(huì)出現(xiàn)變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明膽汁樣本4℃存放30 d內(nèi)，膽汁α淀粉酶總體活力仍相對穩(wěn)定。離心速度增加到8 000 r/min，α淀粉酶較原液下降8.98個(gè)百分點(diǎn)，但由于實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)一組異常數(shù)值，膽汁α淀粉酶為負(fù)值。經(jīng)分析，此組肉眼可見大量泥沙，可能影響測定結(jié)果，故將其剔除。在剔除該組異常值后，膽汁樣本離心8 000 r/min，α淀粉酶較原液上升4.74個(gè)百分點(diǎn)，P=0.885?？梢?，在離心8 000 r/min內(nèi)隨著離心速度的增加，膽汁α淀粉酶活力值有一定的變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明膽汁樣本在8 000 r/min內(nèi)，離心前、后膽汁α淀粉酶總體活力穩(wěn)定。

本研究作為臨床多中心開展探尋膽汁成分對膽胰疾病診斷意義的前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)之一，希望通過多中心、多地區(qū)的研究，加強(qiáng)對臨床工作中膽汁樣本保存的質(zhì)量控制。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，筆者集中解決以往研究的不足。樣本離體后的檢測方面，利用實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室及人員安排等優(yōu)勢，取出標(biāo)本后即刻轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，并于30 min內(nèi)迅速檢測膽汁α淀粉酶活力，以求盡可能與離體前一致且準(zhǔn)確。儲(chǔ)存溫度及離心速度方面，選取研究常用溫度4℃保存，且不超過8 000 r/min離心，以模擬并接近樣本暫時(shí)儲(chǔ)存及檢測處理的狀態(tài)。

綜上所述，膽汁于4℃保存30 d內(nèi)，離心速度不超過8 000 r/min時(shí)，膽汁α淀粉酶活力相對穩(wěn)定，說明該溫度、周期及離心速度未影響膽汁α淀粉酶的穩(wěn)定性。膽汁中α淀粉酶活力在-20℃或-80℃等超低溫冰箱保存、離心超過8 000 r/min時(shí)的穩(wěn)定性變化有待進(jìn)一步研究。

表2 不同離心速度膽汁α淀粉酶活力變化（n=9）

表3 不同離心速度膽汁α淀粉酶活力變化（n=8）