馬發(fā)順，崔夢如，時志琪，梁秀麗，宋玉偉，元雪湞

(1.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室，河南 安陽 455000；3.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450000)

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是中草藥黃芪的主要活性成分之一。APS具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能、抗炎等作用[1-3]。張敬芳等[4]的研究發(fā)現(xiàn)APS可降低患糖尿病大鼠的血糖水平，王巖巖等[5]發(fā)現(xiàn)APS對患糖尿病大鼠腎小管的損傷具有良好修復(fù)作用。Chen 等[6]研究顯示APS能使小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)升高。陳茜等[7]研究表明APS可顯著提高蛋雞的脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)。Lin等[8]發(fā)現(xiàn)APS可通過提高機體IgA、IgG、IgM的含量從而提高機體免疫力。左兆云等[9]的研究發(fā)現(xiàn)APS能提高雞蛋品質(zhì)。甄玉國等[10]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬日糧中添加APS可顯著降低料肉比。上述關(guān)于APS的研究多集中于對免疫功能、動物生產(chǎn)性能等方面的影響，關(guān)于APS生物活性檢測方面的研究較少[11]。擬采用線性和非線性回歸方法構(gòu)建檢測模型，并從中選出最優(yōu)模型，作為APS生物活性檢測時的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

128只昆明鼠(18～20 g)購自河南省實驗動物中心。使用獨立送排風(fēng)隔離籠具(IVC)和EVC籠具進行分籠飼養(yǎng)。所用飼料為SPF級全價飼料，由河南省實驗動物中心提供。

1.1.2 試驗儀器和藥品

電子分析天平(型號為AB204-N)購自上海雙旭電子有限公司。無菌注射器(規(guī)格為1mL)購自河南曙光健士醫(yī)療器械集團股份有限公司。黃芪多糖注射液(規(guī)格為100mL:1g)由河南省獸藥廠提供。生理鹽水(規(guī)格為250mL)購自河南科倫藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

采取獨立試驗設(shè)計。8種APS樣品均設(shè)試驗組和對照組，小鼠完全隨機分組，每組8只，共128只。試驗組每只小鼠每天注射APS注射液0.5 mL，對照組小鼠每天每只注射等量生理鹽水，試驗期7 d。最后一次注射后24 h將小鼠處死，稱取體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)等。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

由稱取的體重和脾臟重計算脾指數(shù)(y)，脾指數(shù)=脾臟重(mg)/體重(g)，按照2015版獸藥典規(guī)定，試驗組與對照組脾指數(shù)之差大于或等于2為合格，否則為不合格。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用t檢驗法進行試驗組與對照組間的差異顯著性比較。使用DPS v 7.05進行相關(guān)和回歸分析。分別進行試驗組與對照組體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)間的相關(guān)分析，并分別建立檢測模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 APS生物活性檢測結(jié)果

8種APS樣品生物活性檢測結(jié)果見表1。按照標(biāo)準(zhǔn)判斷，所檢測樣品A、B、C合格，其余不合格。所檢測樣品A、B、C試驗組和對照組脾指數(shù)差異極顯著(P<0.01)，其余檢測樣品試驗組和對照組脾指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，脾指數(shù)差異顯著性檢驗支持APS樣品生物活性檢測檢測結(jié)果。

2.2 體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)間的相關(guān)性

試驗中所有試驗組和對照組各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，試驗組脾指數(shù)(y1)與脾臟重(s1)間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，胸腺重(t1)與體重(w1)間存在顯著正相關(guān)(P<0.05)；對照組脾指數(shù)(y2)與脾臟重(s2)間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其余各指標(biāo)間相關(guān)性均不顯著(P>0.05)。

2.3 檢測模型的建立

2.3.1 試驗組檢測模型

以體重(w1)、脾臟重(s1)和胸腺重(t1)為自變量，以脾指數(shù)(y1)為依變量，建立的直線模型為：y1=6.6956-0.2615w1+0.0388s1+1.6301×10-3t1；建立的二次多項式模型為：y1=-0.923 6+0.058 1w1+0.086 1s1-6.902 3×10-3t1-2.033 7×10-3w1·s1+6.618 8×10-5s1·t1。

直線模型和二次多項式模型擬合度R2分別為0.9978和0.9999。兩模型中自變量與依變量間的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)如表3所示。

由表3可知，直線模型中w1、s1與y1間的偏相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，而t1與y1間偏相關(guān)系數(shù)不顯著(P>0.05)，從3個自變量對依變量通徑分析來看，s1的通徑系數(shù)最大。二次多項式模型中各項偏相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，從自變量對依變量的通徑分析來看，s1通徑系數(shù)絕對值最大，其次是w1·s1項。對試驗組建立的直線模型和二次多項式模型進行比較，二次多項式型模型比直線模型R2值大，擬合誤差更小，且自變量對依變量的偏相關(guān)系數(shù)顯著性更高，所以二次多項式模型更優(yōu)。

2.3.2 對照組檢測模型

以體重(w2)、脾臟重(s2)和胸腺重(t2)為自變量，以脾指數(shù)(y2)為依變量建立的直線模型為：

y2=3.8439-0.1442w2+0.0365s2+1.0468×10-3t2；

建立的二次多項式模型為：

y2=-0.763 3+0.080 7s2+1.407 6×10-3w22+5.732 3×10-5t22-1.615 8×10-3w2·s2-3.001 5×10-4w2·t2。

直線模型和二次多項式模型擬合度R2分別為0.998和0.9999。兩模型中自變量與依變量間的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)見表4。

由表4可知，直線模型中w2、s2與y2間的偏相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，而t2與y2間偏相關(guān)系數(shù)不顯著(P>0.05)；從3個自變量對依變量通徑分析來看，s2的通徑系數(shù)最大。二次多項式模型中各項偏相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)；從通徑分析來看，s2通徑系數(shù)絕對值最大，其次是w2·s2項。直線模型與二次多項式模型比較來看，二次多項式模型的R2值大于直線模型，擬合誤差小，且各自變量的偏相關(guān)系數(shù)顯著性更高，所以二次多項式模型更優(yōu)。

表4 對照組自變量與依變量間偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)

2.4 檢測模型的驗證

將各樣品試驗組和對照組的測量值分別代入優(yōu)化模型，所得擬合值及差值見表5。根據(jù)y1與y2的差值判斷APS生物活性是否合格，差值大于等于2為合格，小于2為不合格。根據(jù)模型計算的8種樣品試驗組與對照組的脾指數(shù)擬合值及差值與實際檢測結(jié)果完全相同，可見，按照現(xiàn)行的判斷標(biāo)準(zhǔn)所建立的2個模型是可行的。

表5 樣品試驗組與對照組的脾指數(shù)擬合值及差值

3 討論與結(jié)論

從8種樣品的各指標(biāo)測定結(jié)果來看，數(shù)據(jù)變異程度較大，試驗組與對照組的差異顯著無明顯的規(guī)律性。原因可能是：①在試驗設(shè)計時沒有考慮小鼠的性別因素；②試驗動物的個體差異較大，試驗雖然遵照隨機原則但不能完全消除動物的個體差異；③試驗的樣本量不是特別充足。今后，在進行APS生物活性檢測時，應(yīng)遵守重復(fù)、隨機、局部控制原則進行試驗設(shè)計，并盡可能增加樣本量，以降低試驗誤差。

從相關(guān)分析來看，試驗組和對照組均是脾臟重與脾指數(shù)間存在極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，而胸腺重與脾指數(shù)間相關(guān)不顯著(P>0.05)，在直線回歸分析時偏相關(guān)系數(shù)也證實了變量間的相關(guān)關(guān)系。各變量間的相關(guān)分析結(jié)果與元雪湞等[12]的研究結(jié)果相吻合。通徑分析表明，無論試驗組還是對照組，直線模型中脾臟重對脾指數(shù)的影響最大，二次多項式模型中脾臟重及體重與脾臟重的互作項對脾指數(shù)的影響較大。

本研究經(jīng)過優(yōu)化獲得的試驗組和對照組的二次多項式檢測模型擬合度均高于直線模型，也高于元雪湞等[12]建立的直線模型，說明二次多項式模型更適合于APS生物活性檢測。按照2015版獸藥典的APS檢測方法，若把胸腺重也納入到檢測模型中，可提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性。從試驗數(shù)據(jù)代入模型驗證情況看，胸腺重的納入更能證明模型的可靠性。

通過試驗建立了APS生物活性檢測模型，試驗組為y1=-0.923 6+0.058 1w1+0.086 1s1-6.902 3×10-3t1-2.033 7×10-3w1·s1+6.618 8×10-5s1·t1；對照組為y2=-0.763 3+0.080 7s2+1.407 6×10-3w22+5.732 3×10-5t22-1.615 8×10-3w2·s2-3.001 5×10-4w2·t2。二次多項式型模型更適用于臨床APS的生物活性檢測。