易滬萍 ，張福楊 ，劉謙 ，羅小江

（江西省人民醫(yī)院,1.普外科；2.病理科，南昌 330006）

彌漫性大 B 細胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL) 是一種高度異質性的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤， 是成人非霍奇金惡性淋巴瘤最常見的類型之一。據(jù)報道，歐美國家非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL) 中 30%為 DLBCL， 而在我國，DLBCL 發(fā)病率高達 40%[1,2]。 由于 DLBCL 的臨床和生物學異質性,許多學者致力于研究有效的生物標志物來預測預后和幫助患者的臨床管理[3]。

Livin 是抗凋亡蛋白中的一員， 通過抑制蛋白的活性而阻止凋亡進程[4]。近年來，越來越多與DL BCL 相關免疫標志物被發(fā)現(xiàn)，研究表明 Livin 蛋白在彌漫大B 細胞淋巴瘤中表達水平增加[5]，然而其表達與 DLBCL 患者生存期的關系有待進一步研究。 本研究旨在分析 Livin 的表達與彌漫性大 B細胞淋巴瘤臨床病理特征、 疾病進展及患者預后的關系， 為臨床治療方案的確定和預后的判斷提供實用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集江西省人民醫(yī)院病理科2012年1 月 至 2013 年6 月間首次診斷為DLBCL 的石蠟包埋標本80 例,利用免疫組織化學法檢測Livin蛋白在DLBCL 中的表達情況,聯(lián)合檢測 CDl0、bcl-6、MUM-l 進行 Hans 法分型[2]，由 2 位資深病理醫(yī)師根據(jù)腫瘤組織學特征和免疫表型綜合分析并明確診斷。 全部研究對象符合世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2016 年造血和淋巴組織腫瘤修訂版分類的診斷標準[6]。 最終納人研究80例（“雙打擊”或“三打擊”高級別 B 細胞淋巴瘤病例未納入本研究對象），所有患者均未經(jīng)任何治療、有完整的臨床和病理資料。本次研究所有標本均獲得患者本人或者家屬知情及同意，同時經(jīng)江西省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意其實施?；颊吣挲g32-80 歲，中位年齡 52 歲，＜60 歲者 32 例，≥60 歲者48 例。 男 46 例，女 34 例。 病變部位：淺表淋巴結43 例，胃腸道 18 例，腸系膜 9 例，脾 2 例，扁桃體 8 例。 其中，28 例患者有 B 癥狀，52 例無 B 癥狀。 有結外癥狀者 55 例， 無結外癥狀者 25 例。DLBCL 組中，根據(jù) Ann Arbor 分期標準[7]，53 例患者臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期，27 例為Ⅲ、Ⅳ期；38 例患者淋巴瘤國際預后指數(shù) （international prognostic index，IPI）＜2 分 ， 42 例 患 者 IPI ≥2 分 。 根 據(jù)Hans 法分型顯示非生發(fā)中心B 細胞樣亞型（nongerminal centre B-cell-like，non-GCB 型）58 例,生發(fā)中心 B 細胞樣亞型 （germinal centre B-celllike，GCB 型）22 例。

1.2 方法

1.2.1 所用試劑 濃縮型 Livin 兔抗人多克隆抗體購于 Abcam（香港）公司；一抗 CD20、PAX-5、CD3、CD5、CD30（Ber-H2） 、Bcl-2（SP66）、C-myc（Y69）、CD10 （56C6）、 Bcl-6 （LN22）、MUM-1（MUM1p）、CD5 （SP19）、CD138 （MI15）、LMP-1（CS1）、CD21（EP64）、EDTA 抗 原 修 復 液 、 二 硝 基 聯(lián) 苯 胺（DAB）及即用型二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或兔IgG 聚合物）均購于邁新生物公司。

1.2.2 組織芯片 首先制作 2.5cm×2.0cm×0.5cm 大小的空白蠟塊 2 個，設計 1 個 5×8 點、1 個 5×9 點組織微陣列。 根據(jù) DLBCL 的 HE 切片，每例選定1 個典型的腫瘤取樣位點；用自制的穿刺針將所選定的組織穿刺取出(直徑 3 mm)，并植人預先制備的“受體”蠟塊中，起始端空兩孔作為標記，并畫圖記錄病理號，3um 厚連續(xù)切片，烤片后根據(jù)抗體說明做免疫組織化學染色。

1.2.3 免疫組化 免疫組化采用 EnVision 兩步法，石蠟切片厚度 4μm，經(jīng)脫蠟至水后，3% H2O2孵育10min 除去內(nèi)源性過氧化物酶。 用 pH=7.2-7.4 的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，3min/次， 根據(jù)不同抗體說明選用不同 PH 值EDTA 修復液或濃度為 0.01mol/L、pH=6.0 的檸檬酸緩沖液高壓熱修復，待修復液降至室溫甩干，滴加一抗 4°冰箱孵育過夜，PBS 緩沖液輕柔沖洗 3次，3min/次，除去 PBS 緩沖液后，滴加即用型二抗50μl，37℃恒溫箱孵育約 30 min。 PBS 沖洗 3 次，3min/次，DAB 染色液顯色后沖洗，蘇木素復染。 鹽酸分化，乙醇脫水 3 次，二甲苯透明 3 次，濕封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 結果判斷 LMP-1 染色定位于細胞質；CD 10、CD5、CD21、CD30 染色定位于細胞膜；C-myc、Bcl-6、MUM-1 染色定位于細胞核；Livin 染色定位于細胞核、 細胞質；BCL-2 染色定位于細胞質、細胞膜。結果采用半定量法判定， 通過評估染色強度和計算腫瘤細胞陽性率來計分。 根據(jù)著色強度評分主要包括 4 類：0 分（無著色）；1 分（淡黃色）；2分（棕黃色）；3 分(棕褐色)。 腫瘤細胞陽性率計分：采用高倍視野計數(shù)每個組織芯上全部腫瘤細胞及其著色的陽性細胞， 然后計算出陽性腫瘤細胞占所有腫瘤細胞數(shù)的百分比， 根據(jù)細胞陽性率評分亦分 4 類：0 分為無腫瘤細胞著色；1 分為＜5%腫瘤細胞著色；2 分為 5%-50% 腫瘤細胞數(shù)陽性著色；3 分為＞50%腫瘤細胞數(shù)著色。綜合著色強度與腫瘤細胞陽性率的評分，兩者相加＜2 分為陰性，2-6 分為陽性。 由病理科 2 位高年資病理醫(yī)師鏡下觀察切片，判定染色結果，不能達成一致意見時，另外請病理主任醫(yī)師觀察切片， 一起商榷最終染色結果。

1.2.5 隨訪 所有納入研究的患者進行 9-83 個月隨訪 ，通過撥打患者家屬電話進行隨訪，內(nèi)容主要涉及患者生命體征，飲食、大小便，生活質量、近期復查報告及用藥等情況。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 總生存(OS)期的計算從診斷確立到患者死亡或者隨訪終止。采用統(tǒng)計軟件（SPSS 17.0）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用卡方（χ2）檢驗及Fisher 確切概率法分析 Livin 蛋白表達與 DBLCL患者臨床病理特征及病理亞型的關系， 探究其表達與患者預后的關系。 單因素生存分析利用Kaplan-Meier 分析和 Log-rank 檢驗，以 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Livin 蛋白在彌漫大 B 細胞淋巴瘤的表達 利用免疫組織化學染色觀察Livin 蛋白在80 DLBCL腫瘤組織中的表達情況。實驗結果表明，Livin 蛋白染色主要定位于細胞質、細胞核（圖 1）。Livin 在 80例DLBCL 組織標本中， 其中50 例陽性表達 Livin蛋白，Livin 陽性表達率為62.5%。

2.2 Livin 蛋白的表達與DLBCL 患者臨床病理特征的關系 Livin 表達情況與DLBCL 患者臨床病理學特征的關系見表 1。 Livin 在臨床為I、II 分期的DLBCL 組織中高表達率為 54.72%， 臨床分期為III-IV 的DLBCL 組織中陽性表達率為 77.78%,差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。 Livin 在病理分型為GCB 型的DLBCL 組織中陽性表達率為 22.73%，在non-GCB 型的DLBCL 組織中陽性表達率為 77.59%,表達差異顯著（P＜0.05），與 DLBCL 患者性別、年齡、B 癥狀、IPI 評分、結外病灶無關（P＞0.05）。

2.3 Livin 蛋白的表達與DLBCL 患者生存期的關系 為了明確Livin 表達與患者預后的關系， 我們利用Kaplan-Meier 分析和Log-rank 檢驗探究其與患者生存期的關系。結果顯示，Livin 高表達患者中位生存期為 51 個月,不表達Livin 蛋白患者中位生存期長達 66 個月。 Livin 表達水平與 DLBCL 患者生存曲線的差異有關（P＜0.05，圖 2）。 Livin 在臨床為I、II 分期的DLBCL 組織中的表達與患者的生存期無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在臨床分期為 IIIIV 的DLBCL 組織中的表達與患者的生存期有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖 3）。 高表達 Livin 可參與彌漫性大B 細胞性淋巴瘤的進展，提示預后不良。

3 討論

圖1 Livin 及其他蛋白在彌漫性大B 細胞淋巴瘤中的表達模式圖A 腫瘤細胞CD20 膜染色陽性EnVision 法高倍放大圖B 腫瘤細胞CD5 細胞膜染色陰性EnVision 法高倍放大圖C (非生發(fā)中心)腫瘤細胞 Livin 核、胞質染色陽性EnVision 法高倍放大 圖D腫瘤細胞C-myc 染色陰性EnVision 法高倍放大圖 E 腫瘤細胞Bcl-2 細胞質、細胞膜染色陰性EnVision 法高倍放大圖F 腫瘤細胞Bcl-6 核染色陽性EnVision 法高倍放大圖G （生發(fā)中心）腫瘤細胞Livin 核、胞質染色陽性EnVision 法高倍放大圖H（Ⅰ/Ⅱ期）腫瘤細胞Livin 核、胞質染色陽性EnVision 法高倍放大圖I（Ⅲ/Ⅳ期）腫瘤細胞Livin 核、胞質染色陽性EnVision 法高倍放大圖J 淋巴結反應性增生Livin 陰性EnVision 法高倍放大

Livin 又名黑色素瘤凋亡抑制蛋白(melanoma inhibitor of apoptosis protein， ML-IAP )或腎凋亡抑制蛋白 (kidney inhibitor of apaptosis protein, KIAP), 是人凋亡抑制蛋白 (human inhibitor of apoptosis proteins, IAPs) 家族的重要成員， 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8,9]。 目前研究表明,人類主要有8種 IAP:cIAP1、cIAP2、NAIP、XIAP、ILP -2、Bruce、Survivin 及 Livin[10]。 Livin 蛋白是 IAP 家族中新的一員, 是從人類基因組 cDNA 庫中由 IAP 同源序列克隆獲得, 可抑制半胱氨酸蛋白酶 (Caspase) 死亡效應結構域活性[11]。Livin 定位于染色體20q13.3,具有兩種異構體,分別為 Livin-α、Livin-β,其 cDNA長度分別為897、843bp,二者分布雖有一定差異,但總體上變化不大[11,12]。正常成人機體中Livin 只表達于胚胎及胎盤組織,未見于其他組織。 近年研究發(fā)現(xiàn),在中晚期結直腸癌[13,14]、乳腺癌[15]、肺腺癌[16]、髓母細胞瘤[17]等腫瘤瘤組織中，Livin 異常高表達，且其陽性表達者預后較差。 同時也提示Livin 可能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 本組研究結果表明,在DLBCL 中Livin 陽性率約為62.5%，且其陽性表達與臨床分期分期密切相關, 進一步證實Livin 參與了 DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展過程。 GCB 型 DLBCL 患者Livin 陽性表達率顯著低于非GCB 型者,提示Livin可能與DLBCL 的起源有關。

表1 彌漫大B 細胞淋巴瘤中Livin 表達與臨床病理特征的關系

目前認為,Livin 抑制細胞凋亡主要通過兩個途徑,即激活TAK1/JNK1 信號通路[18]、抑制Caspase途徑[19]。 細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)是由Caspase 家族引起的級聯(lián)反應。 此外,有研究表明,利用反應核苷酸技術(antisenseoligonucleotides, ASO),將硫代磷酸酯修飾的Livin 導入膀胱癌細胞中, 可以有效地靶向抑制Livin 的表達和削弱腫瘤細胞的增殖能力[20]。同時, 靶向抑制Livin 的表達可以增加腫瘤細胞對放療和化療藥物的敏感性[21],可作為設計和選擇分子靶向藥物的基礎。我們相信,通過對Livin 的深入研究, 特別是靶向抑制Livin 蛋白的表達, 有望為DLBCL 的診治提供一種理想的腫瘤治療方向。

圖2 Livin 的表達與DLBCL 患者預后

圖3 Livin 的表達與不同分期DLBCL 患者預后

綜上所述，Livin 在評估DLBCL 患者預后狀況中具有較高的判斷價值，Livin 的表達可能提示預后不良的趨勢。 是否可以通過檢測Livin 的表達情況，為DLBCL 患者尋找新治療方案提供理論依據(jù)仍需進一步研究。

利益沖突

本研究不存在利益沖突。

作者貢獻

易滬萍：免疫組織化學染色，論文撰寫；張福楊：收集標本，參與實驗，數(shù)據(jù)整理；劉謙：切片制作、閱片；羅小江：研究設計、經(jīng)費支持。