楊 揚(yáng)，王家平，白彝華，李天祎，李嘉琦，張 婭

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎病進(jìn)展至終末期腎病必經(jīng)的共同病理途徑［1-2］，也是加速疾病惡化的關(guān)鍵因素，使得慢性腎病患者腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆病理改變，導(dǎo)致腎衰竭。目前許多研究表明，腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展可能與缺氧、炎性反應(yīng)、腎臟固有細(xì)胞損傷及促纖維化形成因子參與相關(guān)［3-7］，但具體機(jī)制尚未明確；針對(duì)腎間質(zhì)纖維化的治療手段有限，主要有抗炎、 抗凋亡、 調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）形成與降解等［8-10］，效果不理想。隨著再生醫(yī)學(xué)興起，干細(xì)胞療法展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景。有研究表明，脂肪干細(xì)胞在動(dòng)物腎臟疾病模型中可延緩腎間質(zhì)纖維化［11-12］。本中心前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）對(duì)受損腎組織發(fā)揮積極的修復(fù)作用，能顯著改善腎功能［13］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究 BMSC 對(duì)阿霉素慢性腎病大鼠腎纖維化形成的影響，并探索其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

47 只雄性清潔級(jí) Sprague-Dawley（SD）大鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK滇 K2015-0002）。2 只 4 周齡大鼠，體質(zhì)量 100～120 g，用于 BMSC 體外分離培養(yǎng)。45 只 7 周齡大鼠，體質(zhì)量（261±7.9） g，其中 36 只用于阿霉素造模，9 只作為正常對(duì)照。主要試劑和儀器：低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國 Gibco 公司），阿霉素（美國Sigma 公司），BMSC 成骨成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（賽業(yè)蘇州生物科技公司），抗轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體，蘇木精-伊紅（HE）、Masson 和過碘酸六胺銀（PASM）染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技公司），Eclipse Ci 型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司）。

1.2 制備BMSC

利用BMSC 具有高度黏附于塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶特性，行體外分離培養(yǎng)。根據(jù)宮宇等［14］報(bào)道方法，無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，磷酸緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔，收集沖洗液，用100 μm 細(xì)胞篩過濾去除碎骨片等雜質(zhì)，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗和0.1%非必需氨基酸的低糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合至90%～100%時(shí)予以消化傳代，取P5 代細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀行表面抗原鑒定，行成骨成脂誘導(dǎo)分化。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模與分組

36 只大鼠通過尾靜脈注射阿霉素方式造模，首次劑量3 mg/kg，間歇2 周后，相同劑量再次注射。血肌醉、血尿素氮值和24 h 尿蛋白水平顯著升高后處死大鼠，取腎制作切片并行HE 染色，光鏡下觀察到腎臟結(jié)構(gòu)符合慢性腎病改變提示造模成功［15］。本實(shí)驗(yàn)中第2 次注射阿霉素后7 周左右成模。將造模成功大鼠隨機(jī)分為 M 組（模型組）、A 組、B 組、C 組，每組各9 只；另取9 只健康大鼠作為正常對(duì)照組（N組）。N 組大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.5 mL；A 組、B 組、C 組大鼠參照陸發(fā)承等［16］介入操作方法，通過腎動(dòng)脈途徑分別移植BMSC 懸液0.5 mL，劑量分別 1×106個(gè)/mL、2×106個(gè)/mL、3×106個(gè)/mL；M組則經(jīng)腎動(dòng)脈輸注等量PBS。術(shù)后4 周，處死各組大鼠，取腎組織固定備用。

1.4 主要觀測指標(biāo)

術(shù)后第4 周，觀察各組大鼠一般情況，如毛發(fā)、精神狀態(tài)、活動(dòng)度及體重改變等。處死大鼠取腎組織固定 24 h，石蠟包埋，制作 5 μm 石蠟切片。Masson 染色分析各組大鼠腎臟纖維化情況，計(jì)算膠原纖維面積百分比，隨機(jī)挑選各組腎組織切片，以200 倍視野拍攝，藍(lán)染膠原纖維為陽性信號(hào)，計(jì)算藍(lán)染區(qū)域占整個(gè)面積百分比，評(píng)估纖維化程度。PASM染色比較分析各組大鼠腎小球、 腎小管基膜變化，基膜增厚為陽性區(qū)域，測量陽性面積占視野內(nèi)組織面積百分比。免疫組化染色法觀察分析TGF-β1 和FN 在腎組織不同部位分布情況與表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用方差分析，兩兩比較用最小顯著性差異t 驗(yàn)檢，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

阿霉素造模后大鼠精神狀態(tài)差，毛發(fā)毛躁，缺乏光澤，活動(dòng)度下降，反應(yīng)遲鈍，食欲差，部分大鼠出現(xiàn)輕度腹瀉現(xiàn)象，體重下降。腎動(dòng)脈移植BMSC后，A、B、C 組大鼠食欲改善，精神狀態(tài)好，活動(dòng)靈敏，體重逐漸增加，C 組大鼠較A、B 組改善明顯，但各組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 腎動(dòng)脈移植BMSC 后各組大鼠體重比較 g，

表1 腎動(dòng)脈移植BMSC 后各組大鼠體重比較 g，

a 與 N 組比較，P＜0.05；b 與 M 組比較，P＜0.05

組別 移植前 移植后2 周 移植后4 周N 組（n=9） 298.33±25.04 301.56±25.67 302.56±23.10 M 組（n=9） 272.78±17.77a 266.11±13.23a 266.33±14.57a A 組（n=9） 278.33±14.02a 279.67±13.02a 283.22±12.22ab B 組（n=9） 276.22±12.20a 280.22±11.58a 283.33±11.57ab C 組（n=9） 277.33±11.74a 280.11±11.00a 286.11±8.40ab

2.2 大鼠腎組織Masson 染色與膠原纖維面積測量

N 組大鼠腎組織正常，腎小球囊周圍和腎間質(zhì)均未見著色。M 組大鼠腎小球囊擴(kuò)張，間質(zhì)增寬，部分區(qū)域失去正常腎臟結(jié)構(gòu)，被纖維組織代替，呈大面積藍(lán)染表現(xiàn)，大量腎小球囊及腎間質(zhì)著色；A、B、C組大鼠腎間質(zhì)也存在不同程度增寬，但較M 組窄，腎小球囊和腎間質(zhì)呈不同程度著色改變，但較M 組淺，著色程度為 M 組＞A、B、C 組＞N 組，見圖 1。半定量結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，腎組織膠原纖維面積在 M 組較 N 組顯著增大（P＜0.01），A、B、C 組較 M 組縮?。≒＜0.05），且隨著移植細(xì)胞增多呈減少趨勢，其中 A 組膠原纖維面積大于 B、C 組（P＜0.05），C組纖維化改善情況較B 組好，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

圖1 各組大鼠腎組織膠原纖維沉積比較（Masson 染色，20×）

表2 腎組織膠原纖維、腎小球腎小管基膜增厚面積測量比較 %，

表2 腎組織膠原纖維、腎小球腎小管基膜增厚面積測量比較 %，

a 與 N 組比較，P＜0.01；b 與 M 組比較，P＜0.05；c 與 A 組比較，P＜0.05

組別 膠原纖維面積 基膜增厚面積N 組（n=9） 1.00±0.38 2.31±0.75 M 組（n=9） 24.02±3.05a 16.46±2.98a A 組（n=9） 19.41±2.04ab 14.19±1.84ab B 組（n=9） 15.09±2.10abc 11.94±1.82abc C 組（n=9） 12.49±1.49abc 10.89±1.14abc

2.3 PASM 染色比較各組大鼠腎組織基膜改變

N 組腎小球基底膜、 腎小管基膜未見增厚。M組腎小球基底膜明顯增厚，大量腎小管基膜增厚，PASM 染色見大面積深染區(qū)域；A、B、C 組腎組織亦存在不同程度基膜增厚現(xiàn)象，其中以A 組增厚明顯，B、C 組增厚情況有所緩解，腎小管基膜增厚減少，部分腎小球基底膜增厚，見圖2。半定量結(jié)果分析顯示，與 M 組相比，A、B、C 組腎小球基底膜、腎小管基膜增厚情況均有所改善（P＜0.05），基膜增厚情況為A 組＞B 組＞C 組，而 B 組與C 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

2.4 腎組織TGF-β1 表達(dá)情況

TGF-β1 在N 組腎組織中不表達(dá)或弱陽性表達(dá)，在M 組腎小球和腎小管間質(zhì)、管腔中強(qiáng)陽性表達(dá)，在A、B、C 組腎小球、腎間質(zhì)和腎小管管腔內(nèi)弱陽性表達(dá)，且范圍較M 組小，見圖3。

2.5 腎組織FN 表達(dá)情況

FN 在N 組不表達(dá)或弱陽性表達(dá)，在M 組腎小球、腎小管管腔及上皮細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)，在A、B、C 組腎小球、 腎小管上皮細(xì)胞中呈陽性或弱陽性表達(dá)，但與M 組比較表達(dá)范圍縮小，程度減弱，尤其以C 組改善最為明顯，見圖4。

圖2 各組大鼠腎小球腎小管基膜染色結(jié)果比較（PASM 染色，20×）

圖3 各組大鼠腎組織不同部位TGF-β1 表達(dá)比較（免疫組化染色，20×）

圖4 各組大鼠腎組織不同部位FN 表達(dá)比較（免疫組化染色，20×）

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是ECM 在腎小管和管周毛細(xì)血管間過度沉積導(dǎo)致，其特點(diǎn)是腎間質(zhì)和腎小球均有毛細(xì)血管網(wǎng)破壞丟失及纖維狀膠原沉積，因此間質(zhì)纖維化程度被認(rèn)為是慢性腎臟疾病病程進(jìn)展的最佳預(yù)測因子［17］。研究表明，病理?xiàng)l件下系膜細(xì)胞被激活而過度增殖，系膜細(xì)胞可分泌血管基質(zhì)成分如Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白、FN，使得ECM 產(chǎn)生過多，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，其中FN 為ECM 最主要組成成分，腎小球基底膜增厚則是腎小球硬化直接表現(xiàn)［18］。

本研究采用Masson 染色評(píng)估腎臟纖維化程度，免疫組化染色觀察FN 在腎組織不同部位表達(dá)，PASM 染色比較腎小球基底膜增厚情況。Masson 染色結(jié)果顯示，阿霉素誘導(dǎo)SD 大鼠腎組織發(fā)生腎小球和腎間質(zhì)纖維化，M 組腎組織見大量腎小球和大面積腎間質(zhì)藍(lán)染，著色程度深，而經(jīng)腎動(dòng)脈移植不同劑量BMSC 后，被藍(lán)染的膠原纖維面積呈現(xiàn)減少趨勢，著色淺，其中A 組膠原纖維面積大于B、C 組（P＜0.05），而 C 組纖維化改善情況較 B 組好，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示腎動(dòng)脈移植BMSC 能夠延緩或抑制阿霉素慢性腎病大鼠腎組織纖維化發(fā)生發(fā)展，并隨著移植BMSC 數(shù)量增加而加強(qiáng)對(duì)腎臟纖維化的保護(hù)作用；免疫組化染色結(jié)果顯示，M 組腎小球、 腎小管管腔及上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性，A、B、C 組與M 組相比腎小管管腔中幾乎不表達(dá)，僅在部分腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中呈陽性或弱陽性表達(dá)，尤其以C 組改善最為明顯（P＜0.05），提示阿霉素誘導(dǎo)腎纖維化與ECM 過度沉積有關(guān)，而腎動(dòng)脈移植BMSC 能減少腎組織尤其是腎小管中ECM 過度沉積，改善腎間質(zhì)纖維化；PASM 染色結(jié)果顯示，M 組腎小球基底膜明顯增厚，A、B、C 組與M 組相比腎小球基底膜增厚情況均有所改善（P＜0.05），提示腎動(dòng)脈移植BMSC 能減少腎小球中ECM 過度沉積，緩解腎小球硬化。

關(guān)于腎臟纖維化形成機(jī)制的研究眾多，目前較為一致的觀點(diǎn)是，TGF-β 及其介導(dǎo)的 Smad 或非Samd 信號(hào)通路導(dǎo)致纖維化。TGF-β1 是目前研究最為明確的促纖維化因子，參與導(dǎo)致慢性腎臟病并進(jìn)展至終末期腎病的動(dòng)態(tài)病理過程，其可能通過以下方式促進(jìn)腎臟纖維化：一是TGF-β1 直接誘導(dǎo)ECM形成；二是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）并誘導(dǎo)其拮抗劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）顯著抑制ECM 降解，刺激ECM 積累；三是誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞（如腎小管上皮細(xì)胞）發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），引起成纖維細(xì)胞增生，分泌產(chǎn)生大量ECM；四是直接刺激腎臟系膜細(xì)胞增生，導(dǎo)致ECM 過度沉積［19-20］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測 TGF-β1 表達(dá)變化探索阿霉素誘導(dǎo)腎纖維化的可能機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量（3×106個(gè)/mL）BMSC 通過腎動(dòng)脈移植后能明顯改善大鼠一般情況，尤其對(duì)體重的恢復(fù)較為明顯；與 M 組相比，A、B、C 組 TGF-β1 在腎小球、腎間質(zhì)及腎小管管腔內(nèi)呈弱陽性表達(dá)，不僅程度較M 組弱，且范圍較M 組??；提示BMSC延緩或抑制腎臟纖維化的作用，可能是通過下調(diào)TGF-β1 表達(dá)，從而抑制上述幾種可能作用途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，在以ECM 過度沉積為特征的腎臟纖維化中，BMSC 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的早期腎纖維化形成具有積極的治療作用，其機(jī)制可能是通過下調(diào)TGF-β1 表達(dá)減少ECM 在腎組織不同部位沉積，進(jìn)而發(fā)揮延緩或抑制腎臟纖維化的作用，而高劑量BMSC 效果更為明顯。