劉婷婷 ，劉海蕓 ，鄒燕 ，方全鋼 ，丁偉榮 ,2，柯波 ,2，朱青秀

（1.江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，南昌 330006；2.江西省血液腫瘤細胞生物學(xué)重點實驗室，南昌 330006；3.江西省人民醫(yī)院檢驗科，南昌 330006）

急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）是一種根據(jù)形態(tài)學(xué)、細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征具有多種亞型分類的惡性血液腫瘤，此類疾病遺傳背景復(fù)雜，具有高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為骨髓異常造血，并且傾向于老年患者（超過60%的患者年齡＞60 歲）[1]，因此在臨床診療中需要結(jié)合患者的遺傳學(xué)特點給予分層個體化治療。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年應(yīng)用PCR 技術(shù)從大鼠垂體腫瘤細胞中首次擴增，并發(fā)現(xiàn)其在正常垂體細胞中表達為陰性[2]。 隨后研究發(fā)現(xiàn)PTTG1 為一種保全素抑制姐妹染色單體分離并在多種腫瘤細胞和惡性血液腫瘤中呈高豐度水平表達， 在正常組織細胞和血細胞中表達水平非常低， 因此可作為分子靶標用于靶向治療[3,4]。PTTG1 作為一種致癌轉(zhuǎn)錄因子， 可參與多種生物學(xué)進程，例如有絲分裂、DNA 損傷修復(fù)、基因調(diào)控、器官發(fā)育和代謝[5-9]。 盡管在實體腫瘤中PTTG1 基因的表達與臨床意義已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是在惡性血液腫瘤鮮有報道，PTTG1 在AML 中表達情況以及其與臨床的相關(guān)性， 國內(nèi)尚未見文獻報道。本研究通過熒光定量PCR 檢測初治AML 和非惡性血液腫瘤對照組以及復(fù)發(fā)AML 組中PTTG1 基因的表達水平， 分析其與臨床指標的相關(guān)性，以期為AML 的分層治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 骨髓標本收集于2017 年9 月至2019 年12 月就診于江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科27例初次診斷為AML 患者，11 例AML 復(fù)發(fā)患者，中位年齡 56.5 歲,其中男 21 例，女 17 例；納入行骨髓穿刺檢查的非血液系統(tǒng)腫瘤疾病患者24 例 (對照組)，中位年齡 49.5 歲，男 13 例，女 11 例。 AML組與對照組患者年齡、 性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0.05) 。

1.2 主要實驗材料 RNA 提取試劑盒（北京天根）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit （德國 Qiagen 公司），Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根），PCR 八聯(lián)管、1.5ml 離心管和 PCR 管（無錫 NEST）,熒光定量PCR 儀（天隆TL988），低溫離心機（安徽中科）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA 提取 用 EDTA 抗凝管收集骨髓血2ml，運送至實驗室后加入紅細胞裂解液，離心后用PBS 清洗后加入1ml RNA 提取試劑，充分混勻后加入200μl 三氯甲烷, 混勻后4℃高速離心15 min； 小心吸取上清液500μl， 并加入等體積異丙醇，混勻后靜置10min；4℃高速離心15min，去上清液，并加入75%乙醇清洗；離心后去上清，待殘余乙醇揮發(fā)后加入 RNase-Free 水溶解RNA 沉淀，核酸蛋白測定儀檢測溶液中RNA 濃度和純度，OD260/OD280 比值處于1.6-2.1 之間的標本進行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.2 cDNA 合成 根據(jù)Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書進行， 取1μg RNA 溶液， 加入 5×gDNA buffer， 共 10μl 于普通 PCR 儀中 42℃反應(yīng)3min； 分別加入 FQ-RT primer、Fast-RT Buffer 和RT Enzyme Mix，共 20 μl 于普通 PCR 儀中 42℃反應(yīng) 20min，85℃反應(yīng) 3min。 反應(yīng)結(jié)束后加入 60 μl RNase-Free 水對cDNA 進行稀釋。

1.3.3 熒光定量PCR 通過Primer 3 軟件設(shè)計擴增引物，PTTG1 引物序列： 上游:5’-GTGGTTGCTAA GGATGGGCT-3’，下游:5’-TTGTTTGAGGGGTCCC TTGG-3’；β-catin 引物序列：上游：5’-GCACTCTT CCAGCCTTCCTT-3’，下游：5’-AGGTCTTTGCGGA TGTCCA-3’。 最后根據(jù) QuantiNova SYBR Green PCR Kit 說明書配置反應(yīng)液，每管加入3 μl 稀釋的cDNA 溶液，按說明書設(shè)置擴增程序并進行熒光定量PCR 擴增，得出擴增曲線和溶解曲線。 采用 2-△△Ct計算 PTTG1 基因的相對定量表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用非配對t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTTG1 在AML 患者骨髓細胞中的表達 熒光定量PCR 分析AML 組、正常對照組和復(fù)發(fā)組患者骨髓中PTTG1 基因的表達水平，AML 組中的表達水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 復(fù)發(fā)組中 PTTG1 的表達水平低于 AML 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表 1。

表1 PTTG1 基因在不同組別患者中表達水平

2.2 PTTG1 基因的表達與AML 患者臨床特征的關(guān)系 研究結(jié)果顯示，大于60 歲AML 患者中PTTG1的表達水平高于小于60 歲的AML 患者， 但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;不同性別之間 PTTG1 的表達水平無明顯差異（P＞0.05）；根據(jù)初治 AML 和復(fù)發(fā)AML 患者的FAB 診斷分型， 分析PTTG1 的表達水平，結(jié)果顯示M2 型AML 中表達水平最高，M1 型中表達最低，但是兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細胞白血?。?中國診療指南 2017 年版》對AML 患者進行危險程度分層[10]，分析PTTG1 的表達水平，結(jié)果顯示，低危組中PTTG1 的表達水平最高，高危組中PTTG1 的表達水平最低，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表 2。

表2 PTTG1 基因表達的臨床相關(guān)性

2.3 PTTG1 基因的表達與AML 患者外周血血細胞計數(shù)和骨髓幼稚細胞比例的關(guān)系 通過分析AML患者外周血血常規(guī)以及骨髓涂片， 對血細胞進行分類計數(shù)，分析其與PTTG1 的表達水平的關(guān)系。研究 結(jié) 果 顯 示 ，WBC ≥50×109/L 的 AML 患 者 中PTTG1 的表達水平高于 WBC＜50×109/L 的 AML 患者，但是差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)血常規(guī)中血紅蛋白濃度判定患者的貧血程度， 分析發(fā)現(xiàn)重度貧血和中度貧血AML 患者中PTTG1 的表達水平明顯低于輕度貧血和正常AML 患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;根據(jù)血小板計數(shù)分為不同組別， 其PTTG1 的表達水平無明顯差異 （P＞0.05）；根據(jù)骨髓涂片中幼稚細胞比例，分為0%-50%和50%-100%兩組， 結(jié)果顯示0%-50%組AML 患者中PTTG1 的表達水平高于50%-100%組， 但是差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表3。

表3 PTTG1 基因表達的外周血血細胞計數(shù)的關(guān)系

3 討論

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年從大鼠垂體腫瘤細胞中首次擴增[2]。ChIP 實驗也證實了PTTG1 作為一種轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄活性， 其可以直接或者間接誘導(dǎo)與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)基因的表達，PTTG1 與c-Myc 基因的啟動子相結(jié)合并誘導(dǎo)表達[11]，除此之外，PTTG1 還通過誘導(dǎo) bFGF、VEGF 和MMP2 基因的表達從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。 PTTG1 除了通過與靶基因的啟動子結(jié)合參與細胞調(diào)節(jié)之外， 還可以與細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合參與細胞活動的調(diào)節(jié)，PTTG1 可以通過與p53、Sp1、USF1 和PBF 等蛋白相合作用來參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[15]。

有學(xué)者對腎上腺皮質(zhì)癌的臨床研究表明，PTTG1 基因過表達組患者的中位生存期為1.8 年，而PTTG1 低表達組患者的中位生存期為9.0 年，結(jié)果提示PTTG1 的表達水平與疾病的預(yù)后相關(guān)并可以作為預(yù)后評估的分子標志物和治療靶標[16]。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)， 在胃癌組織和細胞株中PTTG1 的表達明顯較正常胃粘膜高， 通過對PTTG1 基因的mRNA 和蛋白表達水平進行多因素Cox 回歸分析顯示其表達水平可以作為胃癌的獨立的預(yù)后因素[17]。 在血液腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)在36-70%的多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者中PTTG1 基因過表達， 這部分患者中與增值相關(guān)基因也呈上調(diào)表達趨勢（CCNB1、CCNB2、CDK1、AURKA、BIRC5 和 DEPDC1） 并且與患者預(yù)后相關(guān)，敲除5TGM1 細胞中PTTG1 基因后明顯抑制細胞增殖， 體內(nèi)實驗結(jié)果顯示明顯抑制MM 荷瘤的發(fā)展[18]。 然而，PTTG1 基因的表達調(diào)控在白血病的臨床研究和實驗研究中鮮有報答。 在對PTTG1 基因缺陷的小鼠的研究發(fā)現(xiàn)該小鼠具有血小板減少和骨髓間充質(zhì)干細胞增生低下的現(xiàn)象[19]，還有研究發(fā)現(xiàn)佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)通過誘導(dǎo)PKC/ERK/KLF6 信號通路活化，KLF6 通過與PTTG1 基因啟動子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄， 從而促進 HL60 細胞和 THP1 細胞分化[20]。

盡管多數(shù)研究證實PTTG1 基因在惡性腫瘤和血液腫瘤中呈高表達，但是PTTG1 基因在AML 中的表達及臨床相關(guān)性尚未見報道。 白血病是一種源于分子遺傳學(xué)改變導(dǎo)致造血系統(tǒng)中原始造血細胞出現(xiàn)惡性增生伴隨分化阻滯的惡性疾病， 且具有高度的異質(zhì)性。 以上文獻報道提示，PTTG1 基因的異常表達可能影響血細胞的分化以及生物學(xué)功能。 本研究結(jié)果顯示初治AML 和復(fù)發(fā)AML 中PTTG1 基因的表達水平明顯高于對照組， 而且初治AML 和復(fù)發(fā)AML 中表達無統(tǒng)計學(xué)差異。 但是PTTG1 基因在AML 的發(fā)生發(fā)展過程以及對疾病預(yù)后和危險分層的作用尚未闡明。 本研究也通過分析PTTG1 基因在不同F(xiàn)AB 分型以及臨床危險分層的AML 中的表達，結(jié)果顯示不同F(xiàn)AB 分型和危險程度的AML 患者之間PTTG1 基因的表達并不存在統(tǒng)計學(xué)差異； 但是納入本研究的臨床病例較少，可能對分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。 本研究還分析了不同血細胞計數(shù)和骨髓幼稚細胞比例的患者之間的PTTG1 基因的表達差異， 結(jié)果顯示不同白細胞和血小板計數(shù)以及幼稚細胞比例患者之間PTTG1 的表達無統(tǒng)計學(xué)差異， 重度貧血和中度貧血AML 患者中PTTG1 的表達水平明顯低于輕度貧血和無貧血的AML 患者。有文獻報道PTTG1 可參與白血病HL60 細胞和THP1 細胞分化[20],然而，是否通過參與紅細胞的成熟與分化調(diào)控影響AML患者的貧血狀況，國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻報道，有待通過擴大樣本量進一步的研究。 本課題組前期研究表明NF-κB 陽性表達AML 患者預(yù)后較差，是影響AML 患者預(yù)后的生物學(xué)指標之一[21]。 本研究下一步將研究確定PTTG1 的表達與AML 預(yù)后的臨床相關(guān)性。

綜上所述，PTTG1 基因在AML 患者中表達水平高于非惡性血液腫瘤患者， 提示其可能參與AML 疾病的發(fā)生發(fā)展過程，PTTG1 基因的表達水平可能影響AML 患者的貧血狀況。