張朝輝，冉艾，岳華*

（1.四川省甘孜藏族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

本研究對四川省甘孜藏族自治州某地的發(fā)病牦牛進(jìn)行病原菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，旨在為臨床防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 四川甘孜州某地的天然放牧牦牛于2018年7月中旬開始發(fā)病，至7月底有20多頭死亡。主要臨床表現(xiàn)：精神沉郁，采食量下降，腹瀉，呼吸困難，后期臥地不起等。剖檢病死牦?？梢姼骨挥写罅康S色積水，肝臟腫大出血、實(shí)變，脾臟、肺臟腫大，淋巴結(jié)腫大有出血點(diǎn)。無菌采集病死牦牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織，用于細(xì)菌的分離鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡雌性昆明小白鼠20只，體重20±2 g，購自四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試驗(yàn)用品 綿羊血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、生化鑒定試劑均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清購自鄭州佰安生物工程有限公司；rTaq DNA 聚合酶、PCR 試劑、DNA Marker 等均購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株（大腸桿菌ATCC25922）由西南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的心臟、肝臟、脾臟及肺臟組織接種于綿羊血瓊脂平板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)溶血菌落于含5%馬血清的TSA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。對純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并接種于含5%馬血清的TSB 培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件進(jìn)行增菌培養(yǎng)（160 r/min搖床培養(yǎng)）。

1.5 分離菌株的生化鑒定 參照文獻(xiàn)［1］報(bào)道的方法，將4 株分離菌的增菌液分別取100 μL 接種于氧化酶、果糖、尿素、枸櫞酸鹽、靛基質(zhì)、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖生化培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃培養(yǎng)24h，觀察其主要生化特性。

1.6 分離菌株16S rRNA基因序列的擴(kuò)增 運(yùn)用酚-氯仿法提取分離株的DNA。采用文獻(xiàn)［1］報(bào)道的擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增長度約為1 500 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系：PCR-MIX 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，樣品2 μL，上下游引物各1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃30 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的基因片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 16S rRNA 基因序列的遺傳進(jìn)化分析 在NCBI 上用BLAST 將測序獲得的解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種16S rRNA 基因序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種序列進(jìn)行同源性比對，并從GenBank中下載不同國家、不同宿主、不同時(shí)間且同源性高的解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種10條，運(yùn)用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 對小鼠的致病性 將小鼠隨機(jī)分為5 組（4組試驗(yàn)組，1 組對照組），每組4 只。將4 株解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種分別接種于含5%馬血清的TSB增菌液中，于37 ℃恒溫條件下振蕩（160r/min）培養(yǎng)24h后，取6mL菌液12000r/min離心10min，棄上清，用TSB增菌液調(diào)整菌液濃度至1×109CFU/mL，試驗(yàn)組以0.3 mL/只頸背部皮下注射，對照組注射等量的TSB培養(yǎng)基。觀察小鼠的臨床癥狀，若有發(fā)病小鼠，剖檢觀察小鼠的病理變化。

1.9 藥敏試驗(yàn) 按照WHO推薦的K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取純化的單菌落接種于含5%馬血清的TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。用TSB培養(yǎng)基稀釋菌液至終濃度為1.5×108CFU/mL。用滅菌棉拭子均勻涂布在TSA平板上，待菌液吸收后貼藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。藥敏結(jié)果按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2009年標(biāo)準(zhǔn)判定，以耐藥和敏感記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將病料接種于綿羊血瓊脂平板上，經(jīng)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后，可見灰白色、濕潤、凸起的細(xì)小菌落，周圍有草綠色溶血環(huán)；溶血單菌落轉(zhuǎn)接于含5%馬血清的TSA 培養(yǎng)基上經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h 后，可見光滑、半透明的菌落；革蘭氏染色鏡檢為G+球菌。

2.2 分離菌株的生化特征 4 株分離菌的生理生化特性與解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種的基本一致（見表1），初步判定本次分離的病原為解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種。

表1 分離菌株的生理生化特性

2.3 分離菌株16S rRNA 基因序列的擴(kuò)增 從4株分離菌的基因組DNA中擴(kuò)增出了長約1 500 bp的特異性條帶（見圖1），而陰性對照無擴(kuò)增條帶，與預(yù)期目的片段相符；通過與NCBI 上GenBank 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果與S.gallolyticus subsp.Gallolyticus（GenBank 登錄號：EU163484.1）的同源性為99%，進(jìn)一步證實(shí)4株分離菌為解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種。

圖1 分離菌株16S rRNA基因序列的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 基于16S rRNA 基因序列的遺傳進(jìn)化分析 將4 株分離菌株的16S rRNA 基因序列與不同國家、不同宿主、不同時(shí)間且同源性高的解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種16S rRNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2），結(jié)果顯示：4 株分離菌與近年中國株、日本株、德國株和美國株共9株聚為一支，另外一株日本株單獨(dú)聚為一支。

圖2 解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種16S rRNA基因的遺傳進(jìn)化樹

2.5 對小鼠的致病性 試驗(yàn)組小白鼠在攻毒后6 h 左右均出現(xiàn)行動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，弓腰、豎毛、顫抖，攝食量明顯減少，蜷縮一隅等臨床癥狀，12 h 后出現(xiàn)輕度的腹瀉癥狀。剖檢見小鼠腸壁變薄，腸內(nèi)有黃色黏液，其余組織或器官未見肉眼可見的病變。結(jié)果表明，4 株分離菌對小鼠具有致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用臨床常用的13種抗菌類藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示:4 株分離菌均對萬古霉素、羅紅霉素、紅霉素、左氧氟沙星、頭孢噻肟、利福平、林可霉素、替考拉寧10 種藥物敏感，對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、甲氧芐胺嘧啶、四環(huán)素5種藥物耐藥。

3 討論

牛鏈球菌是一類人獸共患病原菌，包括7 個(gè)不同的種和亞種，常引起人和多種動(dòng)物的腹瀉、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、結(jié)腸癌等疾病，解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種屬于其中之一［2-5］。西班牙Corredoira J等［6］從三家醫(yī)院收集的596份病例中檢測出257 份解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種，均與直腸癌相關(guān)。也有研究結(jié)果表明，24%的鏈球菌感染性心內(nèi)膜炎都是由解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種引起的［7］。目前，國內(nèi)有朱聰智等［1］和楊崇勤等［8］從患者血液及骨髓中分離出解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種的報(bào)道，本試驗(yàn)是國內(nèi)首次在發(fā)病牦牛體內(nèi)檢測到該病原菌，其公共衛(wèi)生意義值得進(jìn)一步研究。

抗菌藥物是治療細(xì)菌病的主要措施，但是近年來關(guān)于該菌耐藥的報(bào)道越來越多。本次藥敏試驗(yàn)表明，分離菌株對萬古霉素、羅紅霉素、紅霉素、左氧氟沙星等敏感，對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、甲氧芐胺嘧啶等耐藥，這一結(jié)果為當(dāng)?shù)刂委熕幬锏倪x擇提供了參考。