許國(guó)洋，付利芝，徐登峰，張素輝

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460）

大量臨床數(shù)據(jù)表明，大腸桿菌引發(fā)的羔羊腹瀉是養(yǎng)羊場(chǎng)的一種常見(jiàn)疾病［1］，本研究圍繞常規(guī)消毒藥物對(duì)大腸桿菌的消毒效果進(jìn)行分析，針對(duì)性解決斷奶羔羊腹瀉常發(fā)的難題，為防控大腸桿菌性羔羊腹瀉提供數(shù)據(jù)支撐，也為羊舍臨床消毒藥物的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及消毒藥物 選用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基對(duì)空氣中的大腸桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。選擇的消毒藥物為聚維酮碘、戊二醛、苯扎溴銨。參照許國(guó)洋等［2］的方法設(shè)計(jì)合成細(xì)菌通用引物，引物序列信息為F：5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 大腸桿菌的分離鑒定 利用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基對(duì)斷奶羔羊舍內(nèi)空氣中的大腸桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，并通過(guò)細(xì)菌通用引物F/R 擴(kuò)增分離菌的16S rRNA 基因序列，PCR 產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 藥物敏感性分析 將直徑為6 mm的空白圓形濾紙片于121 ℃高壓滅菌15 min，烘干備用。將處理好的空白紙片置于含有消毒藥物的西林瓶中，12 h后取出，37 ℃烘干備用。采用常規(guī)紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B），檢測(cè)分離到的大腸桿菌對(duì)不同藥物的敏感性。測(cè)得的抑菌圈直徑＜10 mm，表示對(duì)藥物不敏感，抑菌圈直徑在10～15 mm 表示對(duì)藥物中度敏感，抑菌圈直徑＞15 mm 表示對(duì)藥物高度敏感。

1.4 羊舍空氣中的細(xì)菌檢測(cè) 采用自然沉降法檢測(cè)消毒前后羊舍空氣中的大腸桿菌數(shù)量變化。將各培養(yǎng)基暴露于空氣中5 min，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后對(duì)平板中的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均使用SPSS 2.0 統(tǒng)計(jì)分析。

舍內(nèi)空氣中菌落數(shù)的計(jì)算公式為：細(xì)菌數(shù)（CFU/m3）＝N×100/A×5/T×1 000/10＝50 000N/AT。式中，A為平板面積（cm2），T為平板暴露時(shí)間（min），N為平板平均菌落數(shù)（CFU）。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定 通過(guò)對(duì)斷奶羔羊舍內(nèi)空氣中大腸桿菌的分離鑒定，獲得1株革蘭氏陰性短桿菌。利用細(xì)菌通用引物，在1 500 bp 位置擴(kuò)增出單一條帶，測(cè)序結(jié)果表明其大小為1 468 bp，見(jiàn)圖1。在NCBI 中比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與大腸桿菌（NCBI 登錄號(hào)：NR_024570.1）的同源性最高（達(dá)99%）。

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)測(cè)定大腸桿菌對(duì)不同藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)苯扎溴銨高度敏感，抑菌圈直徑達(dá)21 mm，與聚維酮碘和戊二醛差異極顯著（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 消毒前后大腸桿菌總數(shù)測(cè)定分析 通過(guò)對(duì)消毒前后舍內(nèi)空氣中大腸桿菌的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)消毒前后各圈舍空氣中的大腸桿菌數(shù)均發(fā)生變化，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 消毒效果分析 通過(guò)對(duì)消毒前后各組大腸桿菌數(shù)量的變化分析，發(fā)現(xiàn)消毒后聚維酮碘組與苯扎溴銨組的大腸桿菌數(shù)均減少，戊二醛組和對(duì)照組升高。其中，苯扎溴銨組與戊二醛組、對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），與聚維酮碘組差異顯著（P＜0.05）；聚維酮碘組與戊二醛組、對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），戊二醛組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖2。

表2 消毒前后大腸桿菌數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2 消毒前后大腸桿菌數(shù)量變化

3 討論

當(dāng)前，羊群的集中化管理給疫病的傳播創(chuàng)造了良好條件，因此，環(huán)境消毒尤為重要［3］。腹瀉是一種胃腸道性疫病，病原菌感染是其主要病因。隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌誘發(fā)的羔羊腹瀉問(wèn)題日益嚴(yán)重［4］。大腸桿菌具有多個(gè)血清型，存在區(qū)域性差異，且易產(chǎn)生耐藥性，因此，開(kāi)展針對(duì)斷奶期羔羊腹瀉的研究十分必要［3］。

沉降法檢測(cè)出的環(huán)境微生物數(shù)量，可以客觀地反應(yīng)空氣污染的程度和衛(wèi)生通風(fēng)情況，是判斷空氣污染的指標(biāo)之一，也是評(píng)判空氣消毒除菌效果的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨與聚維酮碘的殺菌效果明顯，經(jīng)其消毒后空氣中大腸桿菌的含量均下降，其中又以苯扎溴銨的消毒效果最好。綜合考慮藥物的消毒效果和舍飼山羊的發(fā)病情況，建議對(duì)羊場(chǎng)消毒程序作優(yōu)化改進(jìn)，推薦使用聚維酮碘和苯扎溴銨輪換對(duì)斷奶羔羊舍進(jìn)行舍內(nèi)消毒。