陳秀秀，孫洪浩，孫小涵，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，沈陽(yáng) 110000）

2020年7月1日起，隨著中國(guó)全面進(jìn)入飼料無抗新時(shí)代，各種替抗產(chǎn)品層出不窮，益生菌是替抗產(chǎn)品中最具發(fā)展?jié)摿Φ娘暳咸砑觿┲?。益生菌的?yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在幾個(gè)方面：一是發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酶類，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收提高飼料轉(zhuǎn)化率；二是促進(jìn)蛋白和維生素的生成和代謝；三是抑制腸道內(nèi)致病菌的繁殖，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，維持腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡；四是調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能；五是減少動(dòng)物糞便中的刺激氣體的產(chǎn)生凈化空氣減少污染[1]。

凝結(jié)芽孢桿菌作為可以形成芽孢的益生乳酸菌，在2013年被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部正式列入《飼料添加劑品種目錄》。凝結(jié)芽孢桿菌作為新型微生態(tài)制劑，因其既具有芽孢桿菌的特點(diǎn)，還具有乳酸菌的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于食品、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。本研究評(píng)價(jià)了凝結(jié)芽孢桿菌G4 菌株的生長(zhǎng)曲線、抑菌性、耐抗生素能力、產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酸能力等益生性指標(biāo)，旨在為凝結(jié)芽孢桿菌作為飼用添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康仔豬腸道內(nèi)容物；金黃色葡萄球菌（SA）、大腸埃希氏菌（K88）由本實(shí)驗(yàn)室保存；MRS 培養(yǎng)基、MRS 肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生化鑒定所用試劑購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；乳酸試劑盒及各種酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，抗生素藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 菌株分離純化

取5 g樣品于100 mL富集培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。富集液80 ℃水浴作用20 min，梯度稀釋，MRS 培養(yǎng)基傾注37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取疑似單菌落進(jìn)行3 次平板劃線純化菌株，將分離純化的菌株于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株生化鑒定

1.3.1 生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)分離菌株進(jìn)行明膠液化、55 ℃生長(zhǎng)、吲哚試驗(yàn)、7%氯化鈉生長(zhǎng)、V-P 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇發(fā)酵和溶菌酶生長(zhǎng)等生化試驗(yàn)。

1.3.2 16S rDNA序列測(cè)定

細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，引物16S rDNA 通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATC?MTGGCTCAG-3'和1492 R：5'- TACGGYTACCTT?GTTACGACTT-3'進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增。16SrDNA 的PCR 擴(kuò)增體系（30 μL）：Super Mix 15 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板DNA（ng·μL-1）1 μL、ddH2O 12 μL。PCR 反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性5 min；96 ℃變性20 s， 62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，將有目的條帶的PCR 產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列與GenBank 中序列進(jìn)行Blast 分析比較，用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 生長(zhǎng)曲線及pH曲線

菌種活化后，1%接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 h 取樣1 次，測(cè)定600 nm處吸光度值及pH。繪制生長(zhǎng)曲線和pH曲線。

1.5 抑菌性試驗(yàn)

菌種活化后，1%接種量接種到100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r·min-1充分振蕩48 h 即為所需菌液，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.45 μm 濾膜過濾備用。調(diào)整大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌濃度吸光值約為0.05，測(cè)定600 nm 處吸光度。實(shí)驗(yàn)組為4 mL 指示菌液加1 mL 實(shí)驗(yàn)菌液，對(duì)照組為4 mL 指示菌液加1 mL 生理鹽水。37 ℃200 r·min-1充分振蕩共培養(yǎng)3 h，觀察菌體的渾濁情況。測(cè)定所有試管液體的600 nm 處吸光度值，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=[（A空-A空0）-（A樣-A樣0）]/（A空-A空0）×100%

1.6 耐抗生素試驗(yàn)

采用的是K-B 紙片擴(kuò)散法?；罨N1%接種于MRS液體培養(yǎng)基中搖瓶震蕩培養(yǎng)48 h 后，調(diào)整試驗(yàn)菌濃度為2×108cfu·mL-1，涂布平板。貼上藥敏紙片，正置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 產(chǎn)酸能力鑒定

取5 mL 37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌體發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，用生理鹽水稀釋10倍即為待測(cè)液。設(shè)置空白組、標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)定組，分別加入0.02 mL雙蒸水、3 mmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，各管均加入1 mL 酶工作液，0.2 mL 顯色劑，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)10 min 后，加入終止液1 mL ，混勻，測(cè)定各試管液體的530 nm 處吸光度值，雙蒸水調(diào)零。乳酸含量計(jì)算公式如下：

1.8 產(chǎn)酶能力鑒定

1.8.1 淀粉酶（AMS）

取5 mL 37 ℃培養(yǎng)過夜后菌體發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設(shè)置空白組、測(cè)定組，加入底物緩沖液0.5 mL，待測(cè)樣品0.1 mL，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)7.5 min 后，測(cè)定管加入3.0 mL，空白管加入3.1 mL，其余各管均加入0.5 mL碘應(yīng)用液混勻，測(cè)定各試管液體的660 nm 處吸光度值，雙蒸水調(diào)零。淀粉酶活力計(jì)算公式如下：

1.8.2 蛋白酶

取5 mL 37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌體發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設(shè)置樣品組和對(duì)照組，吸取400 μL 反應(yīng)液至離心管中，樣品組加入100 μL 待測(cè)樣品，對(duì)照組加入100 μL 陰性液，混勻，37 ℃孵育30 min后，加入500 μL 終止液，渦旋震蕩5 s，冰槽里孵育15 min，4 ℃3 000 r·min-1離心15 min，吸取500 μL 上清液，加入500 μL 中和液，混勻，測(cè)定各組440 nm 處吸光度值，雙蒸水調(diào)零。蛋白酶活力計(jì)算公式如下：

1.8.3 乳糖酶

取5 mL 37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌體發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設(shè)置空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組、測(cè)定組、對(duì)照組，分別加入25 μL 雙蒸水、25 μL 5.55 mmol·L-1葡萄糖液、25 μL 待測(cè)樣品，各組均加入50 μL 底物，混勻，37 ℃孵育20 min，各管均加入25 μL終止液，對(duì)照管加入25 μL 待測(cè)樣品，混勻，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液40 μL加入1 mL顯色液，混勻，37 ℃孵育15 min，測(cè)定各組505 nm處吸光度值，雙蒸水調(diào)零。乳糖酶活力計(jì)算公式如下：

1.8.4 纖維素酶

取5 mL 37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌體發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。第1步是制作糖化液上清，設(shè)定測(cè)定管和對(duì)照管，分別加入50 μL 勻漿上清和煮沸勻漿上清，各組均加入50 μL 緩沖液、200 μL 底物和50 μL蒸餾水，混勻，37 ℃孵育30 min后，立即放入沸水中煮沸15 min，流水冷卻，4 000 r·min-1離心10 min，即為糖化液上清。第2 步是顯色反應(yīng)，設(shè)置空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組、測(cè)定組、對(duì)照組，分別加入50 μL 雙蒸水、50 μL 2 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、50 μL 測(cè)定樣品、50 μL 對(duì)照樣品，各組均加入150 μL 顯色液，混勻，沸水浴15 min，流水冷卻，均加入1 mL 蒸餾水，混勻，測(cè)定各組550 nm處吸光度值，雙蒸水調(diào)零。

2 結(jié) 果

2.1 生理生化鑒定

對(duì)G4 菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見表1。由表1 可知，菌株明膠液化陰性，V-P 反應(yīng)為陽(yáng)性，55 ℃生長(zhǎng)為陽(yáng)性，其他結(jié)果詳見表1。上述結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的分析進(jìn)行比較，初步鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌[2-3]。

表1 菌株G4的生理生化特征

2.2 16S rDNA序列測(cè)定

對(duì)G4菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后，分析比對(duì)所得序列與GenBank中的序列，并用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1）。結(jié)果顯示該菌與NCBI 公布的凝結(jié)芽孢桿菌LA204 和DSM2314 的同源性達(dá)到100%，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步將該分離菌鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌。

2.3 生長(zhǎng)曲線及pH曲線

由圖2 可知，G4 菌株在4 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入平臺(tái)期，pH在24 h可達(dá)4.8左右。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌G4的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌G4生長(zhǎng)曲線及pH曲線

2.4 抑菌能力

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，分析凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌活性。G4 菌株對(duì)共培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別是91.0%和95.1%，均超過90%以上，具有一定程度的抑菌作用。

2.5 耐抗生素能力

凝結(jié)芽孢桿菌G4對(duì)抗生素的耐受能力見表2。

由表2 可知，大多數(shù)抗生素對(duì)凝結(jié)芽抱桿菌G4 都有較高的抑制能力，G4 只對(duì)桿菌肽是耐藥的，結(jié)果表明，臨床用藥中凝結(jié)芽胞桿菌G4 可以與桿菌肽同時(shí)使用，而不能與其他抗生素共用。

2.6 產(chǎn)酸能力

研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌因其厭氧和較好抗逆性被作為工業(yè)生產(chǎn)乳酸的主要微生物之一。由表3 可知，與乳酸菌LP28 相比，G4 產(chǎn)酸量約為乳酸菌產(chǎn)酸量的50%，具備一定的產(chǎn)酸能力。

2.7 產(chǎn)酶能力

采用發(fā)酵液法對(duì)G4 菌株的胞外酶產(chǎn)酶活性進(jìn)行測(cè)定。由表4 可知，菌株G4 產(chǎn)淀粉酶量最多，可達(dá)到213.99 U·mg-1prot，其次是乳糖酶酶活力是45.98 U·mg-1prot，蛋白酶量較少，纖維素酶未檢出。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌G4對(duì)抗生素的耐受能力

表3 凝結(jié)芽孢桿菌G4的產(chǎn)酸能力

表4 凝結(jié)芽孢桿菌G4的產(chǎn)酶能力

3 討 論

近年來，凝結(jié)芽孢桿菌因其良好的抗逆性和益生特性成為飼料微生物添加劑的研究熱點(diǎn)。許多研究結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌具有多種生物特性，例如抗菌、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抗炎、改善機(jī)體免疫功能、促進(jìn)消化吸收和改善仔豬腹瀉等。Abada證明凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌的作用[4]。Jensen GS 等報(bào)道凝結(jié)芽孢桿菌GanedenBC30?不僅具有抗炎的作用，在先天性免疫中也發(fā)揮重要的作用[5]。Sudha 等也證實(shí)凝結(jié)芽孢桿菌IS2 可以抑制炎癥因子IL-12、TN-α和IFN-γ的表達(dá)，還能抑制環(huán)氧化酶COX-2 的生成，從而抑制NF-κB P65 蛋白（Rel A）的表達(dá)[6]。Benson 等還發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌GanedenBC30TM代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)更多抗原遞呈細(xì)胞成熟，進(jìn)而改善機(jī)體免疫功能[7]。Keller 等證明凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30 可增加蛋白消化率，轉(zhuǎn)換更多的小肽和游離氨基酸，從而促進(jìn)植物蛋白消化和吸收[8]。

通過對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌G4 的益生特性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌株具有較好的抑菌能力，對(duì)致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，菌種對(duì)大部分抗生素均高度敏感，在臨床用藥過程中不能同時(shí)使用。乳酸是凝結(jié)芽孢桿菌代謝的主要產(chǎn)物之一，G4菌株產(chǎn)乳酸量為48.05 mmol·L-1，凝結(jié)芽孢桿菌是工業(yè)產(chǎn)乳酸的理想微生物因其在厭氧條件和50 ℃以下可發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乳酸。凝結(jié)芽孢桿菌同時(shí)具備相應(yīng)的產(chǎn)酶能力，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶等[9-12]。G4菌株產(chǎn)淀粉酶量最多，酶活力為213.99 U·mg-1prot，許多研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)淀粉酶所使用微生物最多的是凝結(jié)芽孢桿菌。G4 菌株產(chǎn)乳糖酶酶活力是45.98 U·mg-1prot，產(chǎn)蛋白酶較少酶活力為0.094 U·mg-1·min-1。綜上所述，凝結(jié)芽孢桿菌G4菌株具有良好的益生特性，為研制飼料微生態(tài)制劑提供菌種參考。