劉亮，朱旭，張超，韓曉書(shū)

撫順市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113006

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，其惡性程度高、易浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差，患者的5年生存率不足5%，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外胰腺癌的發(fā)病率均呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。早期診療和評(píng)估病情對(duì)于延長(zhǎng)胰腺癌患者的生存時(shí)間、改善其預(yù)后十分關(guān)鍵。臨床研究認(rèn)為，胰腺癌預(yù)后差與腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、早期轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[2-3]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種糖基化磷蛋白，參與肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多種實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、侵襲等過(guò)程[4-6]。因此，推測(cè)OPN與胰腺癌的預(yù)后具有一定的關(guān)系。目前關(guān)于OPN在胰腺癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道，且尚未有準(zhǔn)確定論。基于上述理論基礎(chǔ)及既往文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織中OPN的表達(dá)情況，并分析其與胰腺癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2016年12月?lián)犴樖兄行尼t(yī)院收治的胰腺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌，符合《胰腺癌診治指南（2014版）》[7]中胰腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②非急診手術(shù)患者；③術(shù)前未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療；④病理組織接受OPN檢測(cè)；⑤病歷資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生存時(shí)間＜6個(gè)月；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并自身免疫疾病及全身疾患；④合并血液系統(tǒng)疾病；⑤合并嚴(yán)重軀體疾病；⑥合并全身急慢性感染；⑦合并心臟病、糖尿病、冠心病等嚴(yán)重內(nèi)科疾??；⑧合并器質(zhì)性功能障礙。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入75例胰腺癌患者，收集胰腺癌組織75例及癌旁組織（距胰腺癌組織≥5 cm）30例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法及結(jié)果判定

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）法檢測(cè)OPN的表達(dá)情況。術(shù)中取得胰腺癌組織或癌旁組織，石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，63℃烤箱中烘烤1 h，然后分別置于二甲苯及100%、90%、80%乙醇中浸泡，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。采用枸櫞酸鹽進(jìn)行微波抗原修復(fù)，降至室溫后水洗，然后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。滴加一抗（工作濃度為1∶600），4 ℃孵育24 h，PBS沖洗3次，每次1 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加SP試劑，37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、干燥、中性樹(shù)脂封片。采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

OPN陽(yáng)性主要表現(xiàn)為棕黃色顆粒沉著。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤5%為0分，5%＜陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%為1分，25%＜陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞50%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相加，0～3分為陰性，≥4分為陽(yáng)性[8-9]。

1.3 觀察指標(biāo)

比較胰腺癌組織和癌旁組織中OPN的表達(dá)情況，分析胰腺癌組織中OPN表達(dá)與患者臨床特征（性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）的關(guān)系。采用門(mén)診、電話(huà)隨訪或走訪等形式對(duì)患者進(jìn)行3年隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2019年12月，記錄所有患者的生存時(shí)間，分析胰腺癌患者預(yù)后的影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中OPN表達(dá)情況的比較

OPN陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中。胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率為65.33%（49/75），明顯高于癌旁組織的20.00%（6/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.655，P=0.000）。

2.2 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN表達(dá)情況的比較（ n=75）

2.3 生存情況

截至隨訪終點(diǎn)，所有患者均全部完成隨訪，75例胰腺癌患者中，15例患者生存，60例患者死亡，3年生存率為20.00%（15/75）。

2.4 胰腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

不同性別、腫瘤直徑的胰腺癌患者的3年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。年齡＜55歲、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、OPN陰性表達(dá)的胰腺癌患者的3年生存率分別高于年齡≥55歲、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、OPN陽(yáng)性表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 胰腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析（ n=75）

2.5 胰腺癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（年齡、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及OPN表達(dá)情況）作為自變量，以胰腺癌患者預(yù)后作為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及OPN表達(dá)情況均是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表3 胰腺癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析（ n=75）

3 討論

胰腺癌是目前臨床中預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，以手術(shù)、放化療為主的傳統(tǒng)治療方式療效有限，患者的生存時(shí)間較短[10]。研究認(rèn)為，胰腺癌患者的生存時(shí)間與諸多因素密切相關(guān)，而腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移則是影響預(yù)后的重要原因，因此，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)情況的分析是臨床研究熱點(diǎn)及改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵[11-12]。OPN是一種分泌型糖基化磷蛋白，廣泛存在于機(jī)體體液、胃腸道、胰腺、肺等組織中，且在細(xì)胞的黏附遷移、組織修復(fù)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[13]。隨著腫瘤研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)OPN參與了多種實(shí)體瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)[14-15]。關(guān)于OPN參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化等過(guò)程的作用機(jī)制，相關(guān)研究指出，OPN能夠激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化NF-κB，并使其由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因位點(diǎn)或κ位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的活性，提高其表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[16-17]。國(guó)外研究指出，腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的OPN均能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)體瘤試驗(yàn)中，均能夠得出OPN與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的結(jié)論[18]。OPN又稱(chēng)為早期T淋巴細(xì)胞活化因子，是一種多功能細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，不僅能夠影響腫瘤遷移、侵襲中細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能，還可影響宿主細(xì)胞的免疫功能。OPN與CD44分子結(jié)合后，可增加髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的生成，發(fā)揮免疫抑制功能，從而逃避腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

本研究比較了OPN在胰腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，OPN陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率為65.33%，明顯高于癌旁組織的20.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明OPN在胰腺癌組織中高表達(dá)。國(guó)外相關(guān)研究表明，與正常胰腺組織比較，胰腺導(dǎo)管癌組織中OPN過(guò)表達(dá)，且胰腺癌患者血漿中OPN的濃度亦明顯升高，與本研究結(jié)果基本一致[19]。本研究進(jìn)一步比較了不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明OPN陽(yáng)性表達(dá)與胰腺癌患者的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，臨床分期晚、腫瘤分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽(yáng)性表達(dá)率較高。腫瘤分化程度預(yù)示著腫瘤的惡化程度，在臨床上能夠提示患者的預(yù)后情況，而臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則通常被認(rèn)為是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。以上結(jié)果說(shuō)明OPN在胰腺癌病情進(jìn)展、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，并影響患者預(yù)后。

美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的報(bào)告指出，胰腺癌患者的1年生存率為8%，5年生存率為3%，中位生存時(shí)間為2～3個(gè)月[21]。本研究通過(guò)3年的隨訪發(fā)現(xiàn)，75例胰腺癌患者的3年生存率為20.00%，略高于上述研究報(bào)道的結(jié)果，可能與本研究納入的樣本量少、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析存在偏倚有關(guān)。胰腺癌患者預(yù)后受多種因素影響，本研究采用單因素及多因素Logistic回歸模型分析胰腺癌患者預(yù)后的影響因素，結(jié)果顯示，年齡＜55歲、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、OPN陰性表達(dá)的胰腺癌患者的3年生存率分別高于年齡≥55歲、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、OPN陽(yáng)性表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及OPN表達(dá)情況均是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），說(shuō)明臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、OPN陽(yáng)性患者的預(yù)后往往更差。OPN陽(yáng)性的胰腺癌患者大多進(jìn)展至晚期，且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此生存時(shí)間更短，預(yù)后不良，提示OPN能夠作為評(píng)估胰腺癌病情及預(yù)后的重要輔助指標(biāo)。

綜上所述，胰腺癌組織中OPN高表達(dá)，且OPN陽(yáng)性表達(dá)與胰腺癌患者的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。OPN表達(dá)情況是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，OPN陽(yáng)性表達(dá)患者的預(yù)后較差，生存時(shí)間較短。