陸娟，馮晨露，趙旭林

南陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居中國惡性腫瘤第2位，病死率居中國惡性腫瘤第5位[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，乳腺癌的發(fā)病年齡趨于年輕化，且呈逐年遞增趨勢，已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一[2]。乳腺癌的分子分型包括三陰性、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性、Luminal A型、Luminal B型，約25%的乳腺癌患者為HER2陽性乳腺癌患者，HER2陽性乳腺癌通常表現(xiàn)出組織學分級高、分化程度低、增殖能力強、轉移能力強等惡性生物學行為，往往預后不良[3]。新輔助化療是HER2陽性乳腺癌理想的治療手段之一，能夠改善患者的生存情況，但患者對化療的敏感性仍是臨床難點[4]。因此，尋找預測新輔助化療療效的生物學標志物對HER2陽性乳腺癌個體化治療方案的選擇具有重要意義。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱 PD-L1）是一種跨膜糖蛋白，能夠阻止淋巴結中抗原特異性T細胞聚積，抑制淋巴結CD8+T細胞增生[5]。拓撲異構酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TopoⅡα）是一種蛋白酶，與DNA復制、轉錄、修復、代謝等密切相關，是蒽環(huán)類藥物作用靶點之一[6]。細胞核增殖相關抗原Ki-67是一種能夠反映細胞增殖狀態(tài)的核抗原，與腫瘤增殖、浸潤、侵襲、轉移等過程相關[7]。研究報道，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌中異常表達，并與乳腺癌發(fā)生及進展密切相關[8-10]。但Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在HER2陽性乳腺癌中的表達情況與新輔助化療療效的關系尚不清楚，本研究對其進行了探討，以期為HER2陽性乳腺癌的早期診斷、預后評估提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年8月至2017年8月于南陽市第一人民醫(yī)院確診的HER2陽性乳腺癌患者的病歷資料。納入標準：①符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》中關于HER2陽性乳腺癌的診斷標準；②女性，單側浸潤性導管癌；③既往未接受手術、放療、化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等抗腫瘤治療；④接受了新輔助化療，方案包括環(huán)磷酰胺+表柔比星+5-氟尿嘧啶（CEF）方案、紫杉醇+表柔比星（ET）方案以及抗HER2藥物；⑤依從性好。排除標準：①合并心、肝、腎功能障礙；②病歷資料不齊全；③合并血液系統(tǒng)疾病；④合并其他惡性腫瘤；⑤合并自身免疫性疾病。根據(jù)納入和排除標準，本研究共納入93例HER2陽性乳腺癌患者，其年齡為25～75歲，平均年齡為（43.6±9.8）歲；≥60歲27例，＜60歲66例；月經(jīng)狀態(tài)：未絕經(jīng)18例，絕經(jīng)75例；腫瘤直徑：≤2 cm 41例，＞2 cm 52例；有淋巴結轉移者55例，無淋巴結轉移者38例；組織學分級：1～2級24例，3級69例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期60例。收集所有HER2陽性乳腺癌患者的乳腺癌組織及其相應的癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器及試劑KD-1508A型組織切片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，二甲苯購自上海繼錦化學科技有限公司，檸檬酸鈉緩沖液購自上海高創(chuàng)化學科技有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自上海廣銳生物科技有限公司，山羊血清購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，兔抗人Ki-67單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人TopoⅡα單克隆抗體購自北京綠源伯德生物科技有限公司，兔抗人PD-L1單克隆抗體購自蘇州派普泰克生物科技有限公司，羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自北京博爾西科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司，蘇木素購自安徽永純生物技術有限公司，梯度乙醇購自上海百由生物科技有限公司，中性樹脂固封劑購自南昌雨露實驗器材有限公司，CX40型顯微鏡購自寧波舜宇儀器有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學染色法檢測Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況。具體方法：采用KD-1508A型組織切片機將其制作成厚度為4 μm的蠟塊連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，PBS漂洗，內(nèi)源性過氧化物酶滅活，加山羊血清封閉，滴加稀釋比例為1∶200的兔抗人Ki-67單克隆抗體、稀釋比例為1∶200的兔抗人TopoⅡα單克隆抗體、稀釋比例為1∶200的兔抗人PD-L1單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加稀釋比例為1∶1000的羊抗鼠IgG，37℃孵育20 min，PBS漂洗，使用DAB顯色試劑盒進行顯色5 min，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，中性樹脂固封劑封固。由兩位病理科醫(yī)師使用CX40型顯微鏡觀察陽性細胞率和著色程度。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 Ki-67、TopoⅡα、PD-L1主要定位于細胞核，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。依據(jù)陽性細胞所占百分比和染色強度進行評分，將二者評分之積作為最終得分，0～3分判定為陰性，＞3分判定為陽性。Ki-67、TopoⅡα、PD-L1均陽性判定為Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達，否則為Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達[10]。

1.3 觀察指標

比較Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達情況。采用Miler and Payne（MP）治療反應評價系統(tǒng)評價新輔助化療（不包括靶向治療）的療效，其中，1～2級判定為無效，3～5級判定為有效[3]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；計數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況

免疫組化染色結果顯示，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1主要定位于細胞核，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒狀（圖1）。Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織中的陽性表達率分別為67.74%（63/93）、58.06%（54/93）、35.48%（33/93），分別明顯高于癌旁正常組織中的12.90%（12/93）、9.68%（9/93）、5.38%（5/93），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=58.112、48.606、25.929，P＜0.01）。

圖1 Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況（免疫組織化學染色，×200）

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達情況的比較

不同年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡα、PD-L1的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。組織學分級為3級、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67的陽性表達率均高于組織學分級為1～2級、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=10.065、18.810、12.205，P＜0.05）。組織學分級為3級、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的乳腺癌患者乳腺癌組織中TopoⅡα的陽性表達率均高于組織學分級為1～2級、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.618、9.893、11.885，P＜0.05）。組織學分級為3級、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-L1的陽性表達率均高于組織學分級為1～2級、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=6.172、10.665、13.990，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1的陽性表達情況（ n=93）

2.3 乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達情況與新輔助化療療效的關系

不同Ki-67、TopoⅡα、PD-L1表達情況乳腺癌患者的新輔助化療療效比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達的乳腺癌患者新輔助化療有效的比例明顯高于Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達的乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.341，P＜0.01）。（表2）

表2 不同Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達情況乳腺癌患者的新輔助化療療效（ n=93）

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，已成為危害婦女健康的常見惡性腫瘤。據(jù)調(diào)查，中國每年新增乳腺癌患病病例約26.9萬，乳腺癌死亡病例約7.1萬[11-13]。HER2陽性乳腺癌約占全部乳腺癌的25%，該分型的乳腺癌分化程度低，增殖、擴散、轉移能力高，多預后不良。新輔助化療是HER2陽性乳腺癌綜合性治療中的重要手段之一，對患者病情具有一定的改善作用，但HER2陽性乳腺癌細胞對化療的耐藥性仍是臨床亟待解決的難題。HER2陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因的生物學過程，其分子生物學機制復雜，因此，尋找預測HER2陽性乳腺癌患者新輔助化療療效的生物學標志物對改善患者預后具有重要臨床指導意義。

PD-L1又稱B7同源體1（B7 homolog 1，B7-H1）或表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274），是免疫球蛋白超家族單體型Ⅰ型跨膜糖蛋白，大小為40 kD，由CD274基因編碼，由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)、跨膜區(qū)組成，廣泛表達于單核細胞、自然殺傷細胞、B淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞。PD-L1能夠與細胞程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）結合，傳導抑制性信號，阻止淋巴結中抗原特異性T細胞聚積，抑制淋巴結CD8+T細胞增生[14-16]。有研究顯示，PD-L1在惡性黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中的表達上調(diào)，提示PD-L1與惡性腫瘤的發(fā)病及病情進展有密切聯(lián)系[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在HER2陽性乳腺癌中的陽性表達率高，且與HER2陽性乳腺癌患者的淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期情況有關，提示PD-L1與HER2陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關。TopoⅡα是一種蛋白酶，存在于原核生物和真核生物中，能夠調(diào)節(jié)DNA空間構象，參與DNA的復制、轉錄、修復、重組、代謝，是蒽環(huán)類化療藥物作用靶點之一。本研究發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα在HER2陽性乳腺癌中的陽性表達率高，這與Shuai[18]的研究結果一致，結果顯示，其表達情況與HER2陽性乳腺癌患者的淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期情況有關，提示TopoⅡα與HER2陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關。核抗原Ki-67與細胞有絲分裂密切相關，在有絲分裂中可維持DNA規(guī)則結構，還與核糖體RNA轉錄有關，能反映細胞的增殖狀態(tài)。Ki-67表達上調(diào)高則提示細胞增殖活躍。本研究顯示Ki-67在HER2陽性乳腺癌中呈高表達，這與相關研究的結果[19]一致，其表達水平與HER2陽性乳腺癌患者淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期情況有關，提示Ki-67與HER2陽性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關。本研究顯示Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達的乳腺癌患者新輔助化療療效有效比例明顯高于Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達的乳腺癌患者，提示Ki-67、TopoⅡα、PD-L1聯(lián)合檢測有助于預測HER2陽性乳腺癌患者新輔助化療療效，從而指導HER2陽性乳腺癌患者個體化治療。

綜上所述，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在HER2陽性乳腺癌中的陽性表達率高，其表達情況與HER2陽性乳腺癌患者的淋巴結轉移情況、組織學分級、TNM分期及新輔助化療療效有關。但本研究納入的病例數(shù)量較少，研究時間較短，且其機制尚不清楚，故有待進一步研究。