劉海旺，張宏旭，劉燃，郝美玲，李春輝#

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1病理科，2乳腺科，3麻醉科，河北 承德 067000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，按性別估算的10種主要腫瘤類型中，乳腺癌在女性中發(fā)病率居第一位，病死率居第二位[1]。已知肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-MET的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與胚胎發(fā)育、組織細(xì)胞修復(fù)密切相關(guān)，而HGF/c-MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及血管生成等[2]。HGF是c-MET的配體，c-MET可以通過自身突變、過表達(dá)等途徑激活其配體HGF的作用，促使相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)人體生物學(xué)和生化功能產(chǎn)生影響[3]。EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和抑制凋亡，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。多個(gè)因子如蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1（Snail family transcriptional repressor 1，Snail1）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2（Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和波形蛋白（Vimentin），它們?cè)谵D(zhuǎn)錄和翻譯等水平誘導(dǎo)EMT[4]。本研究旨在研究HGF/c-MET激酶抑制劑在乳腺癌EMT及細(xì)胞侵襲中的潛在機(jī)制，進(jìn)而了解激酶抑制劑在體內(nèi)外的作用機(jī)制，從而為乳腺癌患者的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。c-MET和E-cad引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)。E-cad、Snail、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，β-actin鼠單克隆抗體和辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的兔抗鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Hy-Clone公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑均購(gòu)自TaKaRa試劑公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，PHA-665752小分子抑制劑購(gòu)自selleck公司，TBST、RIPA裂解液和電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，加入適量含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞每2天換液一次，然后按1∶3比例傳代。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化處理并制備成單細(xì)胞懸液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組包括：空白組（單獨(dú)培養(yǎng)基）、對(duì)照組（培養(yǎng)基+DMSO）、研究組（培養(yǎng)基+0.1 μmol/L PHA-665752組，培養(yǎng)基+0.5 μmol/L PHA-665752組，培養(yǎng)基+1.0 μmol/L PHA-665752組）。

1.2.2 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將乳腺癌MCF-7細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液分別接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)12 h后分為研究組和對(duì)照組，繼續(xù)孵育24 h后，在上述培養(yǎng)基孔中加入終濃度為10%的CCK-8試劑，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（A）值，并繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞活力（%）=（研究組A值-空白組A值）（/對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將基膜基質(zhì)原液和預(yù)冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液按1∶3比例配置上室凝膠液，取50 μl凝膠液均勻覆蓋于Transwell小室底部。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml，吸取100 μl細(xì)胞懸液置于上室孵育24 h，再取出Transwell小室，按照說明書進(jìn)行固定、染色，膜的下室表面細(xì)胞即為侵襲細(xì)胞，顯微鏡觀察染色細(xì)胞，每張片子選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目算出平均值，每組設(shè)置3個(gè)平行小室，重復(fù)3次，以穿膜細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)其侵襲能力。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)量 收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，用Trizol試劑提取乳腺癌MCF-7細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參基因，PCR參數(shù)設(shè)置：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，結(jié)果以熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值輸出，依據(jù) 2-△△Ct公式[5]，計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每組進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取均值。所有上述步驟嚴(yán)格按照說明書操作，引物序列詳見表1。

表1 c-MET、E-cad、 β-actin基因的引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用蛋白提取試劑盒提取研究組和對(duì)照組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的總蛋白，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的蛋白質(zhì)濃度，再經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜至甲醇預(yù)處理過的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），再用脫脂牛奶封閉，滴加兔抗人E-cad、N-cad和Snail一抗（1∶500），4℃孵育過夜，加入TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000）孵育1 h，ECL顯示，收集影像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-MET抑制劑PHA-665752對(duì)乳腺癌MCF- 7細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，分別用0.1、0.5、1.0 μmol/L PHA-665752劑量處理 12、24、48 h后，c-MET激酶抑制劑劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力（F=53.367、116.219、44.758，P＜0.05）。與對(duì)照組比較，0.1 μmol/L PHA-665752處理48 h后細(xì)胞活力降低（P＜0.05）；與0.1 μmol/L PHA-665752組比較，0.5 μmol/L PHA-665752處理24、48 h后細(xì)胞活力均降低（P＜0.05）；與0.5 μmol/L PHA-665752組比較，1.0 μmol/L PHA-665752處理12、24、48 h后細(xì)胞活力均降低（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組乳腺癌MCF- 7細(xì)胞活力的比較（%）

2.2 乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的比較

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，0.5 μmol/L PHA-665752研究組MCF-7細(xì)胞處理24 h后侵襲細(xì)胞數(shù)為（24.33±1.53），少于對(duì)照組的（93.00±5.57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 Transwell法檢測(cè) 0.5μmol/LPHA-665752研究組與對(duì)照組乳腺癌MCF- 7細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×100）

2.3 c-MET、E-cad mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

處理12 h時(shí)，對(duì)照組與0.5 μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF-7細(xì)胞c-MET、E-cadmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。處理24 h時(shí)，0.5 μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF-7細(xì)胞c-METmRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，E-cadmRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞c-MET、E-cad mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞c-MET、E-cad mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

注：*與同時(shí)間對(duì)照組比較，P＜0.05

指標(biāo)c-MET mRNA E-cad mRNA 12 h 24 h 12 h 24 h 0.73±0.02 0.51±0.02 0.40±0.03 0.43±0.03 0.66±0.07 0.24±0.05*0.44±0.02 0.66±0.05*時(shí)間 對(duì)照組0.5 μmol/L PHA-665752 組

2.4 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況的比較

通過形態(tài)學(xué)觀察，與對(duì)照組相比，0.5 μmol/L PHA-665752組MCF-7細(xì)胞處理24 h后較密集、細(xì)胞未拉長(zhǎng)，未出現(xiàn)EMT形態(tài)特點(diǎn)。Western blot結(jié)果顯示，0.5 μmol/L PHA-665752組 MCF-7細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，N-cad、Snail蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表4）

圖2 Western blot法檢測(cè)對(duì)照組與0.5μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF- 7細(xì)胞中E-cad、N-cad、Snail蛋白表達(dá)情況

表4 0.5 μmol/L PHA-665752組與對(duì)照組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表4 0.5 μmol/L PHA-665752組與對(duì)照組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組0.5 μmol/L PHA-665752組E-cad 0.42±0.02 0.62±0.04*N-cad 0.62±0.03 0.41±0.04*Snail 0.71±0.02 0.34±0.05*

3 討論

乳腺癌是全世界發(fā)病率位居前列的腫瘤，也是女性中最常見的惡性腫瘤，每年新增病例209萬(wàn)例（占女性癌癥總數(shù)的24.2%），每年因腫瘤導(dǎo)致60萬(wàn)患者死亡[6]。乳腺觸診結(jié)合高頻超聲篩查乳腺癌并進(jìn)行跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，城鎮(zhèn)婦女乳腺癌發(fā)病率明顯高于農(nóng)村婦女[7]。c-MET基因位于7號(hào)染色體上，由50 kD的胞外α鏈和140 kD的一個(gè)跨膜β鏈通過二硫鍵相連形成異二聚體，受體具有自身磷酸化活性特點(diǎn)[8]。c-MET是HGF的細(xì)胞表面受體，其蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-MET在乳腺癌中過表達(dá)可能參與乳腺癌的進(jìn)展[9]。Motomura等[10]研究提示c-MET和PKCλ共同參與了乳腺癌的進(jìn)展，并導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不良。研究證實(shí)，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（metastasis-associated in colon cancer protein 1，MACC-1）與 c-MET共同參與乳腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及血管生成，與組織分化程度、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)[11]。本研究中，與對(duì)照組比較，使用c-MET激酶抑制劑后c-METmRNA表達(dá)受到抑制，E-cadmRNA表達(dá)升高，說明c-MET激酶抑制劑PHA-665752可以有效抑制HGF/c-MET信號(hào)通路。

當(dāng)腫瘤發(fā)展到一定階段，細(xì)胞侵襲和浸潤(rùn)能力會(huì)隨著腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化而增強(qiáng)。EMT在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)過程中起重要的作用。Tavakolian等[12]研究表明乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征與EMT有緊密聯(lián)系，E-cad的表達(dá)下調(diào)也能顯著增強(qiáng)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，而給予外源性E-cad則能夠抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移；Vimentin表達(dá)的增加與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。周玨等[13]表明E-cad的表達(dá)缺失或下調(diào)使細(xì)胞間的黏附力下降，促使連環(huán)蛋白發(fā)生易位，從而激活相關(guān)的下游信號(hào)分子誘導(dǎo)N-cad等的產(chǎn)生，E-cad下調(diào)及N-cad的高表達(dá)與腫瘤分化差、高侵襲性密切相關(guān)。本研究Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，使用c-MET激酶抑制劑后E-cad蛋白表達(dá)水平升高，N-cad和Snail蛋白表達(dá)水平下降，說明當(dāng)上皮細(xì)胞間黏附能力得到了一定程度的恢復(fù)，上皮細(xì)胞的侵襲性和遷移能力顯著下降。同時(shí)也證明了抑制HGF/c-MET信號(hào)通路后乳腺癌EMT及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移受到顯著抑制，且隨著抑制劑濃度的增加，EMT及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制程度顯著增加，表明在一定程度內(nèi)細(xì)胞的EMT及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與HGF/c-MET信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，利用c-MET激酶抑制劑影響HGF/c-MET信號(hào)通路可以有效抑制乳腺癌EMT及細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與降低c-MET、N-cad和Snail蛋白表達(dá)，升高E-cad蛋白表達(dá)有關(guān)。但調(diào)控HGF/c-MET信號(hào)通路的相關(guān)小分子抑制劑較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中希望可以深入研究c-MET抑制劑對(duì)其他信號(hào)通路及與HGF/c-MET之間交互機(jī)制的作用。