吳穎露，白云，熊艷杰，胡芬

華北理工大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院2018級(jí)生物技術(shù)專業(yè)二班，2生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山063000

3華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000

在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中膀胱癌發(fā)病率居世界第二位[1]，90%的患者為尿路上皮癌。近些年，分子生物學(xué)領(lǐng)域研究不斷深入，生物技術(shù)不斷更新，發(fā)現(xiàn)膀胱癌是多種基因參與并且發(fā)生突變和裂變的過程。增殖抑制基因/線粒體融合蛋白2（hyperplasia suppressor gene/mitofusin 2；HSG/MFN2）與細(xì)胞增殖信息傳遞密切相關(guān)，對(duì)線粒體功能有著重要作用，參與線粒體融合分裂、增殖凋亡等生物學(xué)過程。本研究采用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)HSG/MFN2在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，探討其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月至2017年8月于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)切除的膀胱癌患者的病歷資料。所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診，手術(shù)前均未經(jīng)過任何化療、放療及抗腫瘤藥物治療。共納入50例膀胱癌患者，其中男28例，女22例，年齡35～75歲，平均（57.7±8.2）歲。選取膀胱癌患者的膀胱癌組織石蠟標(biāo)本50例及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本20例。

1.2 主要試劑

本研究所用儀器由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，兔抗鼠多克隆HSG抗體購自美國santacrua公司；鼠單克隆β-actin抗體購自美國sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自美國Therm Scientific公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；SP-9001免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）及枸櫞酸鹽均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法

將收集的石蠟標(biāo)本按常規(guī)處理后4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行梯度酒精脫水、脫蠟，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，一抗用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：HSG/MFN2蛋白陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比的得分之和進(jìn)行陽性細(xì)胞評(píng)定。染色強(qiáng)度：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占百分比：無陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；根據(jù)二者得分之和判定結(jié)果，0～2分為陰性，3～6分為陽性。

1.4 Western blot方法

將標(biāo)本從-80℃超低溫冰箱中取出研碎，經(jīng)過蛋白裂解液提取總蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，每組取20 μg用于檢測(cè)不同膀胱組織中HSG/MFN2蛋白含量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜電轉(zhuǎn)印，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗進(jìn)行雜交，洗膜后加入二抗雜交，再次洗膜后DAB顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)讀取條帶密度值進(jìn)行分析，測(cè)定出各組蛋白條帶與β-actin的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌及癌旁正常組織中HSG/MFN 2蛋白表達(dá)情況的比較

膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白的陽性表達(dá)率為78%，高于癌旁正常組織的20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（42.75±2.11），高于癌旁正常組織的（24.78±3.63），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、圖2、表1）

表1 膀胱癌及癌旁正常組織中HSG/MFN 2蛋白相對(duì)表達(dá)量及陽性表達(dá)情況的比較

2.2 不同臨床特征的膀胱癌患者的膀胱癌組織中HS G/MFN 2蛋白表達(dá)情況的比較

不同分化程度、TNM分期和生長方式膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN 2蛋白表達(dá)情況的比較（ n=50）

3 討論

膀胱癌的發(fā)生與家族遺傳或基因、細(xì)胞因子突變有關(guān)，影響信號(hào)通路，改變細(xì)胞代謝過程，導(dǎo)致多種基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度表達(dá)，臨床上隨著病情的進(jìn)展，患者出現(xiàn)了高腫瘤臨床負(fù)荷癥狀[2-3]。膀胱癌的發(fā)展機(jī)制需要血清學(xué)腫瘤指標(biāo)的進(jìn)一步診斷。HSG/MFN2是中國學(xué)者陳光慧研究大鼠血管平滑肌細(xì)胞利用差異顯示技術(shù)分離得到的基因，命名為細(xì)胞增殖抑制基因，后又命名為線粒體融合蛋白2，它位于線粒體外膜，由757個(gè)氨基酸殘基組成，是能夠介導(dǎo)線粒體融合、分裂，對(duì)線粒體的形態(tài)和功能有著重要調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)[4-5]，與細(xì)胞周期密切關(guān)聯(lián)[6]，并且是一種高度保守的跨膜GTP酶，在腫瘤浸潤、細(xì)胞惡變和轉(zhuǎn)移過程中起著決定性作用。HSG/MFN2的抗腫瘤作用與Ras信號(hào)通路下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路有關(guān)[7-8]，能夠傳遞Ca2+信號(hào)[9]，應(yīng)激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞凋亡等活動(dòng)。HSG/MFN2過表達(dá)促進(jìn)了線粒體膜與線粒體的緊密結(jié)合，增加線粒體的融合度，線粒體延長擴(kuò)大，另外發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的細(xì)胞在G1期細(xì)胞被阻滯，S期及G2期細(xì)胞減少。

本研究通過免疫組化和Westen blot法對(duì)HSG/MFN2蛋白在膀胱癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織。在哺乳動(dòng)物中，線粒體不斷地融合分裂，通過這種方式維持其形態(tài)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡，腫瘤組織在機(jī)體運(yùn)行過程中代謝過快，線粒體不斷調(diào)整功能維持本身所需要的能量，因此加快了線粒體的運(yùn)行，出現(xiàn)HSG/MFN2蛋白在膀胱癌組織中過表達(dá)，與丁煥然等[10]在肺癌組織及郭桃英和潘玫[11]在卵巢上皮性癌組織中的檢測(cè)結(jié)果一致，說明HSG/MFN2蛋白可能是膀胱癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，促進(jìn)線粒體不斷分解和融合蛋白活性[12]，平滑肌細(xì)胞與α-肌動(dòng)蛋白的相互作用[13]，改變肌細(xì)胞功能。另外，本研究結(jié)果顯示，HSG/MFN2蛋白在膀胱癌中的表達(dá)與分化程度、TNM分期和生長方式有關(guān)，隨著腫瘤分化程度的加深，HSG/MFN2蛋白陽性表達(dá)率越高，說明HSG/MFN2具有促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的作用；隨著TNM分期升高，HSG/MFN2陽性表達(dá)率降低，說明在代謝過程中HSG/MFN2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14]。

綜上所述，在膀胱癌組織中HSG/MFN2陽性表達(dá)率提高，相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，對(duì)膀胱組織病變的發(fā)展過程有著重要的參與和調(diào)控作用。