陳小波， 何 星

（上海理工大學 材料科學與工程學院，上海 200093）

骨重建由激活、再吸收、逆轉、形成和終止5 個階段組成，此過程中成骨細胞（osteoblast，OB）、OC、骨細胞（osteocyte）等基本的多細胞單元（basic multicellular unit，BMU）參與重建，另外巨噬細胞（macrophage，MP）、B 淋巴細胞和T 淋巴細胞在內的免疫細胞也參與重建[1-2]。骨重建過程中OB 介導的骨形成過程和OC 介導的骨吸收過程緊密聯系，OB-OC 介導的再吸收-形成平衡系統是維持正常骨平衡過程的關鍵[2]。如圖1 所示。平衡系統中OB 分泌核因子κB 受體活化因子（RANKL）作為主要配體與破骨細胞前體細胞（pre-osteoclasts，POC）的受體核因子κB 受體活化因子（RANK）結合，正向刺激POC 的分化及相應骨吸收過程。來自OB、單核細胞以及T、B 淋巴細胞的骨保護素（osteoprotegerin，OPG），可與RANK 競爭性結合RANKL 進而抑制POC 的分化活性，抑制OC 吸收過程促進骨吸收和骨形成[3]。RANKL/RANK/OPG 作為骨吸收過程中重要信號通路維持骨吸收平衡系統，OB-OC 過程因人體病變等因素干擾后，骨吸收-形成平衡過程即會失衡，從而造成骨質疏松或骨質增生等骨科疾病。

圖 1 骨重塑過程破骨細胞與成骨細胞相互作用[2]Fig.1 Interaction between osteoclasts and osteoblasts during bone remodeling[2]

OC 是骨修復過程中唯一多核巨細胞（內含3-50 個緊密堆疊細胞核），主要來源于造血干細胞，也可由樹突狀細胞、B 淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞分化而來。OC 主要分布于骨質表面、骨內血管通道周圍等，重塑階段中負責脫鈣和骨基質的吸收。如圖2 所示，參與骨吸收期間成熟OC 可劃分四種膜區(qū)：封閉區(qū)、皺褶邊緣區(qū)、基底外側區(qū)和功能性分泌區(qū)，皺褶的邊界進一步劃分為外周融合區(qū)和中心區(qū)域，其中封閉區(qū)為環(huán)狀結構。再吸收過程中密封區(qū)緊緊粘附在骨表面，褶皺緣細胞膜釋放H+、Cl-及多種蛋白水解酶（如組織蛋白酶K 和基質金屬蛋白酶）等。OC 與骨表面間形成較高的酸性環(huán)境，骨中礦物質經OC 等骨吸收細胞溶解后溶解為Ca2+，等離子可被OC 吸收轉移。Ca2+為調節(jié)OC 分化、吸收重要信號，可被周圍OB 吸收利用實現骨形成即骨再吸收-骨形成循環(huán)系統。

圖 2 成熟OC 骨吸收反應示意圖[2,4]Fig.2 Schematic diagram of bone resorption in mature osteoclasts[2,4]

如圖3 所示，骨主要由有機物、無機物及水3 部分組成，骨中70%左右為無機物-骨礦物質，主要由HA（主要成分）、碳酸鈣、氟化鈣、氯化鈣及鋅等微量元素組成[5]。骨礦物質中含有微量元素、碳酸鹽及硅等，骨礦物質Ca/P 處于1.37～1.87 之間，HA、β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphat，β-TCP）、雙相磷酸鈣（biphase calcium phosphate，BCP）等與天然骨Ca/P 相近，具備優(yōu)異的生物相容性、骨誘導性、生物降解性、骨傳導性，因而廣泛應用于生物骨修復材料。

圖 3 骨的主要成分[5]Fig.3 Main component of bone[5]

本文針對OC 與常用羥基磷灰石基磷酸鈣材料（HA-CaPs）體外試驗研究結果，探討HA-CaPs 對POC增值分化及OC 吸收活性的影響，并總結HA-CaPs的體內吸收降解機制和體內Ca2+信號對OC 增殖分化吸收活性影響，從而為HA-CaPs 生物材料在骨修復中應用和研究提供理論基礎。

1 羥基磷灰石基體外培養(yǎng)破骨細胞分化和吸收活性

HA、β-TCP 和BCP 因其自身高穩(wěn)定性和較好的生物活性，相對于其他磷酸鈣材料較廣泛應用于骨修復生物材料，現就3 種材料體外培養(yǎng)破骨細胞研究作闡述與總結。

1.1 羥基磷灰石體外培養(yǎng)破骨細胞活性

HA 作為骨無機物礦物質主要物質，是應用最廣泛的骨再生生物材料之一。可利用不同試劑（不同鈣、磷源），利用不同合成方法諸如化學沉淀法、水熱法、固相研磨法、溶膠-凝膠法等制備和調控HA 的形貌、物化性能及結晶度等理化參數[6]。

Spence 等[7]利用酸堿中合法，設定Ca/P 為1.67，制備HA 前驅體，經冷壓成型和高溫煅燒制備HA 陶瓷壓片，高溫消毒后培養(yǎng)人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。利用細胞影像技術、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）及相關基因檢測技術觀察POC 分化和OC 吸收活性，試驗結果表明HA 壓片材料組POC 分化活性較高并可大量觀察到成熟OC，壓片表面出現大量吸收陷窩，OC 吸收效應明顯，說明HA 材料具有很好的促骨吸收效應。Costa-Rodrigues等[8]利用HA 粉末經冷壓成型和高溫煅燒技術制備陶瓷壓片，經不同粗糙度SiC 砂紙組合成不同打磨工序獲得3 種不同表面粗糙度（Ra=0.582，0.187，0.043 μm）的壓片，經高溫消毒處理后培養(yǎng)PBMCs，分化活性結果表明0.187 μm組支架培養(yǎng)OC 分化活性最高，說明支架一定的表面粗糙度有利于提高POC 分化活性；定量分析吸收陷窩總面積，粗糙度較高的壓片表面OC 吸收陷窩面積比光滑表面的高，說明具有一定粗糙度的陶瓷壓片有利于促進OC 分化和吸收活性。

骨礦物質中含有Si 等微量元素影響骨修復過程中OC 再吸收活性，Botelho 等[9]用適量Si(OH)4替代H3PO4與CaCO3反應制備Si-HA，經冷壓煅燒后制備陶瓷壓片培養(yǎng)PBMCs，分析發(fā)現1.5%Si-HA組細胞培養(yǎng)基中鈣和磷酸鹽最多，說明OC 吸收活性較高，因此，Si-HA 可被OC 吸收并且Si 促進OC再吸收。Friederichs 等[10]研究發(fā)現體外培養(yǎng)21 天后的OC 數量在HA、Si-HA（Si 質量分數為0.5%）和Si-HA（Si 質量分數為1.2%）上數量相當，但Si-HA 上的肌動蛋白環(huán)封閉區(qū)形態(tài)與正常骨上的相似，在Si-HA（Si 的質量分數為1.2%）壓片表面觀察到OC 具有較大的尺寸，從而保證OC 具有更恒定的封閉區(qū)，進而提高HA 溶解量，說明Si 在摻入HA 基骨水泥后可提高OC 吸收活性。

1.2 β-磷酸三鈣體外培養(yǎng)破骨細胞活性

β-TCP 的Ca/P 為1.50，處于骨礦物質的1.37～1.87 之間，也是一種常見骨修復材料。β-TCP 具有相對較高的溶解度，Mayr 等[11]比較HA/β-TCP 兩組材料培養(yǎng)POC，比較兩者降解速率并結合OC 分化再吸收試驗結果表明，β-TCP 參與培養(yǎng)POC/OC 時，降解速度較快，導致Ca2+等離子濃度較高，相比HA、BCP 等材料而言抑制相關POC 分化和OC 吸收活性，如圖4 所示。添加微量元素可提高β-TCP 支架力學性能，Roy 等[12]采用β-TCP 粉末與高純度SrO和MgO 混合制備了3 種β-TCP 復合物：β-TCP，β-TCP/1.0%Mg（質量分數），β-TCP/1.0%Sr（質量分數）。經研磨冷壓成型后高溫煅燒制備光滑陶瓷圓片，培養(yǎng)RAW264.7 細胞，試驗結果表明Mg 摻雜可能抑制RAW264.7 細胞分化活性，另有研究表明鋅摻雜β-TCP (Zn/0.25%)（質量分數），POC 分化活性相對會抑制但OC 吸收活性會相對增加[13]。

1.3 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細胞活性

1.3.1 雙相磷酸鈣制備

雙相磷酸鈣（biphasic calcium phosphate，BCP）由HA 和β-TCP 2 種物相混合組成，可通過HA/β-TCP 比例物理復合，可精準調控物相比。另可通過調節(jié)鈣、磷源的Ca/P 介于1.50～1.67 之間生成前驅體缺鈣磷灰石（calcium-deficient apatite，CDHA）高溫煅燒制備陶瓷支架[14]，制備過程中可通過改變反應物Ca/P（1.50～1.67）調控CDHA 中x 值即BCP 中HA/β-TCP 物相比。反應溶液pH 通過影響溶液離子決定產物主要物相β-TCP（pH～7）和BCP（pH≥9）；聶磊等[5]通過調控CDHA 煅燒溫度范圍650～1 300 ℃，利用X 射線衍射儀（X-Ray Diffraction, XRD）分析產物物相發(fā)溫度低于850 ℃時，β-TCP 的XRD 衍射峰較弱，溫度高于1 100 ℃則會出現α-TCP，考慮HA，β-TCP，α-TCP 三相相變溫度區(qū)間說明煅燒溫度對于BCP 物相影響較大。說明通過化學合成法制備BCP 要調控反應物Ca/P（1.50～1.67），反應溶液pH 保持在9～11 高堿性，煅燒溫度保持950～1 150 ℃為最佳制備條件[5]。目前關于BCP 支架制備方法多樣，針對不同制備方法有不同特點和不足，表1 詳細闡述各制備方法優(yōu)缺點。

圖 4 HA 和β-TCP 降解速度（上）和OC 吸收陷窩大小比較HA(下左)和β-TCP(下右)[11]Fig. 4 HA and β-TCP degradation rate (top) and OC absorption lacuna size comparison of HA (bottom left) and β-TCP (bottom right)[11]

表 1 BCP 支架制備工藝特點比較[5,16]Tab.1 Comparison of process characteristics of BCP scaffold[5,16]

1.3.2 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細胞分化活性

Yamada 等[15]利用化學沉淀法制備不同Ca/P缺鈣磷灰石后調控煅燒溫度950 ℃高溫煅燒2 h后，制備4 種不同HA/β-TCP（100/0，75/25，25/75，0/100）BCP 后經成型工藝制備厚度1 mm 陶瓷壓片進行兔骨細胞體外培養(yǎng)。利用SEM 觀察比較細胞培養(yǎng)后壓片表面吸收陷窩的大小，結果發(fā)現雙相條件下細胞吸收活性高于任何一個單相的，相比β-TCP 組吸收活性相對最低，說明高溶解性Ca-P 陶瓷不利于OC 吸收，可能是材料在OC-基質界面的微環(huán)境中產生了高濃度的Ca2+，從而抑制OC 等吸收活性。相對于化學合成的BCP，物理研磨混合可精確調控BCP 材料HA/β-TCP 比值，有利于觀察比較不同比例條件下對OC 等細胞分化吸收活性影響。Detsch等[16]利用噴霧干燥法制備HA、β-TCP 粉體后設定HA/β-TCP 為100/0，60/40，100/0 3 種比例制備漿料，利用3D 打印技術制備生坯支架后經1 300 ℃高溫煅燒后制備成孔隙率體積分數為52～56%的陶瓷支架，高溫消毒后培養(yǎng)小鼠RAW264.7 細胞，用細胞線粒體活性等基因檢測檢測OC 活性、SEM 觀察比較OC 形態(tài)及吸收陷窩形貌觀察。3 種材料對RAW264.7 細胞分化活性影響差別不大，但是，吸收陷窩孔隙尺寸比較結果說明BCP 材料相對提高OC 吸收活性。

1.3.3 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細胞吸收活性

Schaefer 等[17]利用純HA/β-TCP 粉體后以HA/β-TCP 為100/0，60/40，100/0 3 種比例混合，分別利用單向壓制和聚氨酯復型技術制備2D，3D 生坯（孔徑密度為45 ppi）后1 300 ℃煅燒1 h 制備陶瓷支架經高溫消毒后培養(yǎng)RAW264.7 細胞，觀察細胞分化吸收活性。研究發(fā)現2D 陶瓷壓片中BCP（60/40）有利于促進RAW264.7 的破骨分化，HA 次之而β-TCP 則相對效果最差，相應的OC 吸收活性BCP（60/40）組吸收陷窩尺寸較大較明顯說明OC 吸收活性較高，2D/3D同種材料細胞分化吸收試驗結果表明2D 更有利于促進細胞的分化和吸收活性。3D 的陶瓷支架較高的孔隙率加快BCP 材料自身降解速度，從而造成細胞周圍[Ca2+]等離子濃度較高影響細胞分化過程中信號通路進而抑制細胞分化活性，弱化OC 吸收活性。Mayr 等[18]利用HA 和β-TCP 物質混合研磨冷壓燒結制備HA/β-TCP 為100/0，80/20，60/40，40/60，20/80 和0/100，分析可得HA/β-TCP 為80/20，60/40兩種材料最有利于破骨前體細胞分化，因此，HA/β-TCP 比例為80/20 和60/40的BCP 被認為是很有潛力的人工骨替代材料，對于OC 具有最佳的溶解和再吸收性能，如表2 所示。

表 2 HA/β-TCP 與OC 分化/吸收活性關系[17-18]Tab.2 Relationship between HA/β-TCP and OC differentiation/absorption activity[17-18]

表3 為HA，β-TCP 和BCP 體外培養(yǎng)OC 活性比較。HA、β-TCP 和BCP 3 種生物材料參與OC 培養(yǎng)過程和試驗結果說明材料物相、支架形貌及粗糙度等對POC 分化及OC 吸收活性均有影響，POC 分化過程處于動態(tài)變化和不斷遷移過程并且細胞周圍Ca2+等離子均會影響OC 相關活性。生物體內高度復雜的環(huán)境要求磷酸鈣生物材料必須能夠以適當的速度降解，以達到與新骨組織再生的平衡，同時為細胞生長和分化提供理想的場所。

表 3 HA，β-TCP 和BCP 體外培養(yǎng)OC 活性比較Tab.3 Comparison of OC activity in vitro cultured with HA, β-TCP and BCP

圖 5 HA-CaPs 生物體內降解轉化與分化吸收相互作用示意圖[20]Fig. 5 Schematic diagram of the interaction of HA-CaPs in vivo degradation, transformation, differentiation and absorption[20]

2 破骨細胞對羥基磷灰石基生物材料的吸收作用

2.1 羥基磷灰石基生物材料體內降解機制

圖5 為HA-CaPs 生物體內降解轉化與分化吸收相互作用示意圖。HA-CaP 作為生物可降解材料參與OC 等骨吸收細胞進行接觸后，材料自身可自然降解，降解產物主要有等組成。磷酸鈣的生物降解機制有2 種解釋：一種是將物質分散成顆粒，植入的材料首先被分散成微小的顆?；蛩槠?，最后碎片被吞噬細胞轉移；另一種是將物質溶解成Ca2+和HPO42-離子然后被細胞吸收，進行骨骼修復和重建形成新的骨骼[19]。后續(xù)研究發(fā)現，2 種降解溶蝕機制在參與細胞反應中是同時發(fā)生的，Sheikh 等[20]將生物體內植入材料的降解過程歸納為3 種反應（物理、化學、生物反應）和2 個階段（第1 階段：早期溶解；第2 階段：細胞介導吸收）。

HA-CaPs 因自身具有一定溶解度，植入體支架等材料首先會溶解，溶解過程中支架材料中結合較疏松處發(fā)生脫離等現象即出現小顆粒[21]。未成熟OC或巨噬細胞即會識別粒徑小于10 μm 粉體，細胞膜內陷胞吞顆粒進入細胞內部經細胞內反應溶解變?yōu)镃a2+，HPO42-等離子。對于較大的HA-CaPs 顆粒及支架材料細胞介導吸收即OC 吸收，成熟OC 經識別和移動吸附后于HA-CaPs 表面之間形成封閉反應環(huán)[22]。材料表面形成較高的酸性環(huán)境，多數HA-CaPs 穩(wěn)定存在的pH 范圍處于偏堿性范圍，在高強酸環(huán)境下極易發(fā)生溶解及溶蝕即會發(fā)生生物溶解過程[23]。

2.2 羥基磷灰石基生物材料性質對破骨細胞分化、吸收活性的影響

HA-CaPs 經相關細胞吸收溶解及自身物理降解后，對于細胞而言其生理環(huán)境周圍即出現Ca2+等離子。對于生物體而言Ca2+作為體內第二信使，對于OC 的增值、分化及骨吸收過程均有較大的調控影響。OC 生長過程一般為巨噬細胞等POC 經核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)刺激后，單體細胞接觸融合而后形成多核OC。分化過程中已知RANKL 信號可誘導[Ca2+]振蕩變化，導致Ca2+/鈣調神經磷酸酶去磷酸化并且激活NFATc1，NFATc1移位至細胞核誘導OC 特異性基因轉錄使OC 得以分化。盡管少有遺傳學證據表明OC 分化需要[Ca2+]振蕩信號，但在幾乎所有沒有[Ca2+]振蕩的情況下，這一誘導分化過程都會受到損害[24]。這表明[Ca2+]振蕩對于NFATc1 誘導OC 形成至關重要。另研究表明，成熟OC 中[Ca2+]的變化可調控OC 的骨吸收活性，如細胞運動、抑制酶的釋放、抑制核的形成[25]。

3 總 結

巨噬細胞在骨表面遷移融合形成多核OC，OC吸附于HA-CaPs 表面，經物理降解和細胞化學溶解形成Ca2+等離子。相對OC 細胞而言，[Ca2+]作為重要生物信號反向調節(jié)OC 等相關細胞分化吸收活性，因此，HA-CaPs 研究重點即調控材料物相、陶瓷支架孔隙率（比表面積）等材料宏觀降解能力以期在參與細胞吸收過程中所產生的動態(tài)降解過程，符合OC 等骨吸收細胞所需的合適離子環(huán)境。良好生物活性HA-CaPs 植入或培養(yǎng)OC 過程中，其良好生物相容性以保證與OC 等細胞相互影響，構成相對平衡穩(wěn)定的吸收-調節(jié)系統，從而保證骨修復系統的平衡與穩(wěn)定。隨著對離子、分子、藥物和生長因子功能化的HA-CaPs 的相關研究不斷增加，使得用于硬組織修復的HA-CaPs 生物材料的性能顯著提高。關于HA-CaPs 生物學特性及應用的重要發(fā)現，對于在各種臨床應用中尋找理想的骨替代物具有很高的價值。為了更好地理解HA-CaPs 及其植入骨缺損部位后的一系列反應或生物學變化，需要作更多深入研究。