王利樂，劉慶國(guó)，陳 勇,

(1.南京工業(yè)大學(xué) 國(guó)家生化工程技術(shù)中心，江蘇 南京 211800；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 211800)

能源是人類生產(chǎn)與生活的動(dòng)力基礎(chǔ)，燃料乙醇作為一種清潔型燃料，已成為世界各國(guó)的可再生能源研究的熱點(diǎn)，也是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)で笸黄频闹攸c(diǎn)產(chǎn)品[1-4]。其中，生物法生產(chǎn)燃料乙醇的傳統(tǒng)菌株就是釀酒酵母[5]。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)技術(shù)采用游離細(xì)胞發(fā)酵，但此方法存在一系列缺點(diǎn)，而固定化技術(shù)具有一系列優(yōu)勢(shì)，如可以在較高的初始糖濃度下發(fā)酵，而且細(xì)胞在產(chǎn)生較高濃度乙醇的發(fā)酵液中仍可保持活性，并重復(fù)利用，展示出了更高的發(fā)酵效率[6-7]。這些優(yōu)點(diǎn)使得固定化發(fā)酵被應(yīng)用于酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這些優(yōu)勢(shì)主要得益于釀酒酵母細(xì)胞在固定化狀態(tài)下可以形成生物膜，這層生物膜賦予了細(xì)胞更強(qiáng)的抵抗發(fā)酵環(huán)境脅迫的能力，同時(shí)減少了發(fā)酵過程中的葡萄糖抑制作用。

生物膜是微生物的一種普遍的存在方式，因?yàn)槲⑸镌诙嗉?xì)胞群體下的生存能力會(huì)大大提高，所以微生物會(huì)自發(fā)地傾向于形成生物膜或者菌落[8]。超過80%的微生物能夠以一種膜樣生長(zhǎng)的菌落形式存在，外表面被其自身分泌的富含多糖的細(xì)胞外多聚物覆蓋，這種菌群與胞外基質(zhì)組成的有機(jī)體稱為生物膜[9-10]。生物膜能夠形成在生物體或者非生物體的表面，呈膜樣生長(zhǎng)，對(duì)抗菌因子及外界各種壓力有高度抗性。因此，生物膜在工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療方面均被廣泛關(guān)注。如白色念珠菌，在生物膜狀態(tài)下對(duì)抗生素的吸附能力增加4～5倍，所以對(duì)抗生素有極大的抗性，致病能力大幅提高[11]。細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下，海綿狀的胞外基質(zhì)具有吸附/吸收作用，可以影響細(xì)胞與外界之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氣體及其他分子的交換，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以保留在生物膜內(nèi)，使得膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度較高，更有利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]。

生物膜由多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、蛋白質(zhì)激酶A(PKA)途徑，而且群體感應(yīng)也可能會(huì)調(diào)節(jié)生物膜的形成。MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞類型的絲狀分化及生物膜的形成過程[13]，在該途徑激活狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子Tec1可以誘導(dǎo)黏附素基因(如flo11)的轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)量是游離細(xì)胞的2倍[14]；tec1純合子敲除，膜形成能力嚴(yán)重減弱[15]。雷帕霉素作用靶標(biāo)(TOR)信號(hào)途徑控制著營(yíng)養(yǎng)吸收，可以通過Tor2激活葡聚糖合成酶調(diào)節(jié)因子Rho1[16]。Rho1通過調(diào)節(jié)MAPK途徑的組分Pkc1,從而控制細(xì)胞完整性[17-19]。Pkc1細(xì)胞完整性途徑已經(jīng)被證實(shí)參與葡聚糖合成酶fks1基因的表達(dá)[20]。而葡聚糖作為一種生物膜的組分，影響著細(xì)胞的生理特性。在釀酒酵母W303-1A的生物膜中，糖組分主要由葡萄糖、甘露糖及半乳糖組成[21]。在白色念珠菌中，β-1,3葡聚糖與藥物抗性有關(guān)，對(duì)于藥物敏感性起正向作用[10]。但是，不同酵母菌株間具有表型多樣性，生物膜成分、調(diào)節(jié)通路也可能有所差別[22]?；騠ks1編碼β-1,3-葡聚糖酶催化亞基，該基因的缺失會(huì)造成葡聚糖合成酶活性減弱以及葡聚糖合成量的降低。snf1基因的缺失會(huì)影響一系列葡聚糖合成相關(guān)的高爾基體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白以及細(xì)胞表面蛋白基因的表達(dá)[23]，并且當(dāng)snf1缺失時(shí)，fks1、fks2表達(dá)量顯著降低[24]，同時(shí)侵入能力消失，成膜能力下降[25-26]，所以可以推斷生物膜的形成及其強(qiáng)度可能與葡聚糖合成相關(guān)。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，雙倍體釀酒酵母1308在成膜初期fks1基因表達(dá)異常，基于這一現(xiàn)象，筆者欲探索fks1基因是否會(huì)影響其成膜能力。

本研究基于同源重組原理，借助CRISPR技術(shù)的便利性[27]，通過一次轉(zhuǎn)化同時(shí)破壞雙倍體的等位基因fks1，通過分析敲除菌釀酒酵母1308生理生化特性嘗試探究fks1基因?qū)Τ赡さ挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒具體信息見表1。以釀酒酵母1308作為出發(fā)菌株菌，進(jìn)行基因fks1的敲除。

表1 菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmid

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10。制備固體培養(yǎng)基時(shí)，添加20 g/L的瓊脂粉。用于釀酒酵母敲除后轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，添加終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素。

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 20、胰蛋白胨20、酵母粉10。根據(jù)培養(yǎng)的大腸桿菌需要，可加入50 μg/mL的卡那霉素、20 g/L的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖200、胰蛋白胨4、酵母膏4、KH2PO43、(NH4)2SO43、無(wú)水MgSO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。用于釀酒酵母發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

PLATE：40 mL PEG2000(50%)，5 mL醋酸鋰(1 mol/L)，5 mL TE Buffer(10×，100 mmol/L Tris-Cl，10 mmol/L EDTA，pH=8.0)。分別配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Primer STAR高保真聚合酶、酵母基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒，TaKaRa公司；DpnⅠ，NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；single stranded from salmon testes (ssDNA) ，Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 敲除菌的構(gòu)建

使用的引物由蘇州金唯智公司合成，具體序列見表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence

敲除菌株的構(gòu)建采用同源臂重組及CRISPR/Cas9敲除方法的聯(lián)合使用：采用一定長(zhǎng)度的同源臂，可以極大提高外源片段在菌體內(nèi)的重組效率。首先在fks1基因上確定sgRNA位點(diǎn)，后設(shè)計(jì)引物fks1-pCAS-F2及fks1-pCAS-R2，并以質(zhì)粒pCAS為模板擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶切過夜后42 ℃、90 s熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落測(cè)序后獲得sgRNA與Cas9共表達(dá)質(zhì)粒pCAS-fks1。將釀酒酵母fks1基因sgRNA位點(diǎn)前后40 bp長(zhǎng)的堿基序列作為敲除同源臂，連同質(zhì)粒上抗性基因片段前后各20 bp分別作為前后引物，即fks1-KAN-F2、fks1-KAN-R2，序列見表2，然后這對(duì)引物以pYX212-Aur質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增金擔(dān)子菌素基因片段作為敲片，膠回收純化備用。

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[27]，將轉(zhuǎn)化試劑及酵母感受態(tài)細(xì)胞配制成轉(zhuǎn)化態(tài)(表3)，30 ℃孵育30 min后在42 ℃熱激15 min，然后以10 000 r/min離心1 min，將細(xì)胞用250 μL YPD液體培養(yǎng)基重懸，涂布于質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素和400 μg/mL的遺傳霉素G418的雙抗性YPD平板，30 ℃培養(yǎng)36 h，以引物對(duì)fks1-F、fks1-R3進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，即在含有體積為25 μL 0.02 mol/L NaOH的 EP 管中加入適量菌體，混勻，沸水浴 10 min后冰上放置10 min，以此作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

表3 轉(zhuǎn)化體系Table 3 System of transformation

1.2.2 生長(zhǎng)性能、菌株穩(wěn)定性與發(fā)酵性能分析

1)活化。將野生型釀酒酵母1308以及敲除菌△/△fks1-1308接種至裝有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)至OD600為1.0。

將活化的菌液以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)。每隔3 h取樣，根據(jù)測(cè)定的菌體濃度作釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線。

在無(wú)抗生素的YPD固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10個(gè)批次后，將菌體影印到含有0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素抗性的 YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng)1～3 d后，評(píng)估菌株生長(zhǎng)狀況。

2)發(fā)酵。將3 g固定化材料放入250 mL三角燒瓶中滅菌，然后加入100 mL滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%的接種量接入活化的種子液，搖床在30 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行固定化發(fā)酵。

1.2.3 成膜能力表型分析

1)結(jié)晶紫染色。將OD600為0.1的野生型及敲除菌△/△fks1-1308釀酒酵母以10%的接種量接入新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)移至96孔板上，每孔200 μL，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h棄液體培養(yǎng)基，再加入200 μL的0.1%結(jié)晶紫，靜置染色 10～20 min，隨后用300 μL純水洗3遍，洗去浮色，晾干，拍照，最后加入200 μL冰醋酸，通過酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)其OD570。

M為標(biāo)準(zhǔn)DNA；條帶1～10為挑選單菌落擴(kuò)增結(jié)果；條帶0為原始菌擴(kuò)增結(jié)果圖1 DNA凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of DNA

2)絮凝實(shí)驗(yàn)。將活化后的菌液用水稀釋至OD600為1.0，取10 mL移至透明玻璃試管中靜置，分別于30、60和90 min時(shí)拍照，觀察其絮凝狀態(tài)。

3)成膜形態(tài)SEM電鏡。發(fā)酵結(jié)束后取固定化載體材料樣品，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗2遍，-80 ℃冷凍，真空冷凍干燥，然后噴金，通過TEM3000掃描電鏡(SEM)觀察材料表面生物膜形態(tài)。

1.2.4 胞外多糖分析

胞外多糖的制備及總組分測(cè)定。同一批發(fā)酵結(jié)束后得到的固定化載體，用純水沖洗兩遍后，加入0.1 mol/L的NaOH溶液，振蕩5 min溶解胞外基質(zhì)。之后5 000 r/min離心5 min，保留上清液，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃過夜，5 000 r/min離心5 min，保留沉淀并干燥，即為釀酒酵母生物膜的胞外多糖。用純水將樣品制備成0.5 mg/mL的溶液，分別通過苯酚硫酸法、考馬斯亮藍(lán)、二苯胺法測(cè)定其總糖、蛋白質(zhì)、核酸含量[29]。

胞外多糖采用高效液相色譜分析。色譜條件：Aminex HPX-87X Column，流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 敲除菌的構(gòu)建與篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、敲除菌的篩選與鑒定

以fks1-pCAS-F2和 fks1-pCAS-R2為上下游引物，以質(zhì)粒pCAS為模板，PCR擴(kuò)增后熱激法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)中，然后涂布于質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板表面，生長(zhǎng)12～20 h，挑取單克隆于卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL、體積為5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒，進(jìn)行DNA凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒樣品送蘇州金唯智公司測(cè)序，確定質(zhì)粒序列，成功將20 bp靶位點(diǎn)替換，即成功構(gòu)建pCAS-fks1質(zhì)粒(圖1(a))。

以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的pYX212-Aur質(zhì)粒為模板，以fks1-KAN-F2和fks1-KAN-R2為上下游引物，擴(kuò)增帶有fks1基因40 bp同源臂的金擔(dān)子菌素抗性片段，約2 000 bp(圖1(b))，與理論大小一致，說明成功敲除了相關(guān)的基因片斷。

通過CRISPR二合一表達(dá)質(zhì)粒以及敲片的聯(lián)合使用，借助醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pCAS-fks1質(zhì)粒與敲片同時(shí)導(dǎo)入野生型釀酒酵母1308中，通過Cas9蛋白在等位基因上同時(shí)造成切口，同源臂可與目的基因發(fā)生同源重組，即可實(shí)現(xiàn)雙倍體的同時(shí)插入突變，然后涂布于抗性平板初步篩選轉(zhuǎn)化子。最后通過在插入位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，若雙倍體插入成功，使用驗(yàn)證引物fks1-F、fks1-R3進(jìn)行菌落PCR時(shí)，可以擴(kuò)增出一條比原始菌目的片段大2 000 bp左右的單一條帶。最終成功篩選出fks1基因雙倍體敲除菌(圖1(c))，其中條帶0為以原始菌為模板的對(duì)照條帶，條帶3、4代表的菌株為單倍體敲除菌，條帶1、2、6、7、8、10代表的菌株為雙倍體敲除菌，從圖1結(jié)果來(lái)看，該方法獲得目的雙倍體敲出菌株的概率為60%，表明該方法效率較高。保藏雙倍體敲除菌株并命名為△/△fks1-1308。

2.1.2 遺傳穩(wěn)定性

將轉(zhuǎn)化子挑選出來(lái)，在無(wú)抗生素的YPD平板上連續(xù)劃線連續(xù)傳代10次后，劃線轉(zhuǎn)移至添加0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素的YPD平板上可以正常生長(zhǎng)，表明敲除菌性狀穩(wěn)定，未出現(xiàn)退化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2 敲除菌的生理生化性能分析

2.2.1 生長(zhǎng)曲線

測(cè)定原始菌及敲除菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，fks1基因插入失活使其活力降低，生長(zhǎng)速度減慢。經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵及連續(xù)平板傳代之后，敲除菌菌落PCR結(jié)果顯示其抗性基因依然存在并且可以在抗性平板上正常生長(zhǎng)，證明該菌株性能穩(wěn)定。但是，基因缺失使其生長(zhǎng)速度略微下降，原始菌的最大菌體濃度出現(xiàn)在第30 小時(shí)左右，但是敲除菌的最大菌體濃度直到第36 小時(shí)才出現(xiàn)，表明該基因缺失妨礙了菌體的正常生長(zhǎng)。之前Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)fks1單倍體基因缺失后，會(huì)伴隨著生長(zhǎng)速率減慢的現(xiàn)象，這與本研究的結(jié)果一致；而釀酒酵母BY4742 菌株fks1基因缺失后的生長(zhǎng)速率正常，啤酒酵母工程菌G-03/C生長(zhǎng)先慢后快，然后在穩(wěn)定期時(shí)菌體濃度和原菌相差無(wú)幾[32]。這結(jié)果表明基因fks1對(duì)不同釀酒酵母菌株的影響并不完全一致。

圖2 不同菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of different strains

2.2.2 敲除菌結(jié)晶紫染色及絮凝實(shí)驗(yàn)

關(guān)于fks1基因缺失后的細(xì)胞抗逆性能力已有研究，如Wang等[30]證明在一定濃度的NaCl、乙醇、米卡芬凈等壓力環(huán)境中，fks1基因缺失會(huì)造成生長(zhǎng)能力的減弱。微生物在聚苯乙烯表面吸附并形成菌落聚集體被認(rèn)為是形成生物膜的表現(xiàn)之一，結(jié)晶紫染色后則可以直觀地表現(xiàn)出在聚苯乙烯表面吸附菌體的數(shù)量，結(jié)晶紫染色越深，表明菌體量越多。將fks1與成膜能力聯(lián)系起來(lái)，并通過結(jié)晶紫染色與絮凝實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)常用的試驗(yàn)方法表征成膜能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知：敲除菌在96孔板上的著色效果明顯強(qiáng)于原始菌；結(jié)晶紫染色的吸光度數(shù)值越大，聚苯乙烯表面吸附菌體的數(shù)量越多，敲除菌的OD600遠(yuǎn)大于原始菌，表明敲除菌吸附在聚苯乙烯表面的菌體數(shù)量比原始菌多；另外，根據(jù)絮凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，敲除菌的絮凝速度略快于原始菌。由此可見，敲除菌在聚苯乙烯表面的成膜能力及絮凝能力均有所增強(qiáng)，反映了其成膜能力的增強(qiáng)。

2.2.3 平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴(kuò)散生長(zhǎng)試驗(yàn)

成膜能力同樣也可以通過在固體及半固體培養(yǎng)基上的侵入及擴(kuò)散效果來(lái)表征，平板沖洗實(shí)驗(yàn)可以表征菌體侵入能力，是在臨床醫(yī)學(xué)方面研究生物膜特性最常用的分析手段之一，菌體在平板上的殘留量越多，表示侵入能力越強(qiáng)。因此考察平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴(kuò)散生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：在2%的瓊脂糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)單菌落2 d后，敲除菌的菌落較小，所以擴(kuò)散能力弱于原始菌，但其侵入能力卻大大增強(qiáng)，表現(xiàn)為菌落深入固體培養(yǎng)基并持續(xù)生長(zhǎng)；在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7～14 d，觀察到敲除菌較原始菌的擴(kuò)散能力稍弱，表現(xiàn)為菌落表面積較小，這可能與其生長(zhǎng)速度較慢有關(guān)。但Hope等[22]通過觀察多種酵母菌株生物膜相關(guān)表型，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表明雙倍體的侵入能力與聚苯乙烯吸附能力只有弱相關(guān)性，說明僅僅通過表型來(lái)驗(yàn)證成膜能力是不充分的。因此有必要從固定化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)來(lái)探究生物膜的變化。

圖4 平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴(kuò)散生長(zhǎng)試驗(yàn)Fig.4 Plate wash and semi-solid medium expansion growth test

2.2.4 固定化發(fā)酵及材料表面的成膜狀態(tài)

將敲除菌和原始菌進(jìn)行了一個(gè)批次的固定化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。由圖5可知：敲除菌和原始菌的葡萄糖消耗速率分別為(5.36±0.02)、(4.46±0.01) g/(L·h)，乙醇生成速率分別為(2.39±0.01)、(2.02±0.01) g/(L·h)，表明fks1基因缺失后，耗糖速率降低，與之前生長(zhǎng)曲線圖譜的結(jié)果相吻合，生長(zhǎng)速度慢、耗糖速率低導(dǎo)致了乙醇生成速率隨之降低；兩株菌的乙醇得率分別為0.44±0.01、0.45±0.01，兩者產(chǎn)量基本相同，說明fks1基因?qū)σ掖籍a(chǎn)量并未造成顯著影響。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液樣品測(cè)其游離菌體量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除菌游離菌體遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于原始菌，可以側(cè)面反映出敲除菌固定化在載體上的菌體數(shù)量遠(yuǎn)多于原始菌。但是由于基因缺失后，乙醇產(chǎn)率的降低在工業(yè)化生產(chǎn)中非常不利，所以對(duì)于該基因缺失后如何彌補(bǔ)其帶來(lái)的生長(zhǎng)缺陷仍值得進(jìn)一步探究。

圖5 固定化發(fā)酵數(shù)據(jù)及固定化載體掃描電鏡圖Fig.5 Fermentation results and SEM images of immobilization carrier

將固定化發(fā)酵結(jié)束后的載體保留并取樣，取部分材料作為樣品，在TEM3000掃描電鏡下觀察其形態(tài)差異，可以發(fā)現(xiàn)，敲除菌在載體上的附著效果強(qiáng)于原始菌，表現(xiàn)為材料表面黏附的菌體數(shù)量增多且胞外分泌物變得清晰可見，成膜效果更明顯。綜上所述，敲除菌在固定化材料上的成膜效果強(qiáng)于原始菌。

2.3 胞外多糖的組分測(cè)定及高效液相色譜分析

苯酚硫酸法測(cè)定胞外多糖中總糖比例，敲除菌和原始菌分別為7.97%、4.89%；通過考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白，比例分別為2.57%、3.81%，二苯胺法基本無(wú)法檢測(cè)到核酸存在，證明采用的胞外多糖的制備方法比較可靠。但是作為主要成分的多糖含量明顯偏低，主要成分仍未知，Al-Fattani等[33]證明胞外基質(zhì)組分中含有糖醛酸等成分，故對(duì)其組分進(jìn)一步探究。

通過三氟乙酸水解，將糖的多聚物分解為單糖分子，使糖組分及糖醛酸組分通過高效液相色譜可以被檢測(cè)，結(jié)果見表4。由表4可知，胞外基質(zhì)主要組成成分為半乳糖醛酸，同時(shí)含有葡萄糖、甘露糖，其比例分別為88∶ 9∶ 3、92∶ 4∶ 4。其中，fks1基因缺失后，葡萄糖在胞外多糖中的比例明顯降低，甘露糖含量略微上升。fks1基因缺失后，對(duì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能造成了影響，進(jìn)而影響了其通透性及有關(guān)葡聚糖及甘露聚糖相關(guān)合成基因，這是造成胞外多糖成分變化的原因。

表4 胞外多糖組分檢測(cè)Table 4 Analysis of extracellular polysaccharide component

3 結(jié)論

通過構(gòu)建fks1基因雙倍體敲除菌，發(fā)現(xiàn)敲除菌侵入、黏附等成膜表征能力增強(qiáng)，借助SEM直觀地觀察到敲除菌在載體上胞外分泌物的增多，表明成膜能力提高。初步分析了胞外多糖的單糖組成成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了半乳糖醛酸、葡萄糖和甘露糖的存在。當(dāng)fks1基因缺失后，生物膜中葡萄糖組分的比例明顯減小，同時(shí)，甘露糖含量增多，推測(cè)葡萄糖比例減少、甘露糖比例增多可能是生物膜增強(qiáng)的原因之一。因?yàn)楦事短欠肿涌偸且愿事毒厶腔蛘吒事短堑鞍椎男问酱嬖?，所以猜測(cè)在釀酒酵母成膜這一過程中，甘露糖或者甘露聚糖有助于釀酒酵母1308成膜。此前，對(duì)于釀酒酵母fks1基因的研究主要聚集在對(duì)酵母細(xì)胞壁及自溶性能等方面，或是白色念珠菌的藥物互作，本研究將fks1基因直接與生物膜相聯(lián)系，并證明了有相關(guān)性，即首次揭示了fks1基因的缺失會(huì)影響釀酒酵母1308的成膜能力，但生物膜成膜機(jī)制十分復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究探索。