李希羽，高 潔，李云姣，王兆凌，張兆熙，桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

隨著人們生活水平的提高，對(duì)功能性食品的需求與日俱增。酵素以其豐富的營養(yǎng)成分、活性物質(zhì)和健康益處，在亞洲國家深受青睞[1]。水果酵素是以水果為原料，經(jīng)過有益微生物群發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)品。在發(fā)酵過程中通過微生物對(duì)水果自身營養(yǎng)及外加碳源的代謝，使得酵素體系中含有豐富的有機(jī)酸、酶、小分子氨基酸等代謝產(chǎn)物[2-3]，具有多種有益功能活性[1]，受到消費(fèi)者及學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

酵素的發(fā)酵方式分為接菌發(fā)酵和自然發(fā)酵，接菌發(fā)酵是利用一種或者多種微生物作為起始發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵[4]。 自然發(fā)酵主要是依賴于水果和自然環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行發(fā)酵，具有更豐富的微生物組成和代謝過程，其品質(zhì)和風(fēng)味也優(yōu)于接菌發(fā)酵。然而在自然發(fā)酵過程中，酵素體系中的微生物群落構(gòu)成不斷變化，生成不同的代謝物，且又受到代謝產(chǎn)物的影響，使其發(fā)酵規(guī)律難以掌控。目前關(guān)于酵素的研究主要是微生物群落或產(chǎn)物因子的單一研究，高慶超等[5]通過高通量測(cè)序?qū)诠坭浇退卦?～60 d中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，杜麗平等[6]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）研究了木瓜自然發(fā)酵酵素在0～42 d中的微生物多樣性變化，楊小幸等[2]對(duì)自然發(fā)酵蘋果酵素的物質(zhì)代謝變化和抗氧化性進(jìn)行研究。在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵過程中不同時(shí)間的微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝物的變化規(guī)律與酵素的品質(zhì)、功能和安全性密切相關(guān)，發(fā)酵時(shí)間選擇和過程調(diào)控需要結(jié)合微生物的群落結(jié)構(gòu)變化以及產(chǎn)物實(shí)際情況進(jìn)行綜合考慮。其中有機(jī)酸既被微生物用作碳源和電子供體，又是微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，有機(jī)酸積累所導(dǎo)致的酸性環(huán)境還對(duì)某些微生物有抑制作用。因此，亟待進(jìn)行水果酵素發(fā)酵過程中的微生物群落與有機(jī)酸產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化綜合分析與評(píng)價(jià)，這有助于闡明水果酵素的發(fā)酵過程，控制酵素產(chǎn)品品質(zhì)，同時(shí)對(duì)酵素工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以3 種物料與糖典型比例的水果酵素為研究對(duì)象，研究其在發(fā)酵周期0～150 d不同發(fā)酵時(shí)期的微生物動(dòng)態(tài)變化以及7 種主要有機(jī)酸變化過程，運(yùn)用冗余分析（redundancy analysis，RDA）對(duì)微生物群落組成與有機(jī)酸變化聯(lián)合分析，以期揭示水果酵素在自然發(fā)酵過程中的微生物共性演變規(guī)律及在演替過程中有機(jī)酸的環(huán)境推動(dòng)力，為指導(dǎo)自然發(fā)酵水果酵素實(shí)際生產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)水果酵素工業(yè)生產(chǎn)工藝改進(jìn)和產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果、香蕉、梨、山楂、火龍果、香橙、檸檬、柚子、葡萄、獼猴桃、紅糖（一級(jí)品）、白砂糖（一級(jí)品）市購。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索萊寶生物科技有限公司；β-巰基乙醇、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 美國Sigma公司；RNase、6×loading bufferv北京康為世紀(jì) 公司；PCR引物 深圳華大基因科技服務(wù)有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

K5600型超微量分光光度計(jì) 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；TGL 16M高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；S1000TM PCR儀、PowerPac電泳儀 美國Bio-Rad公司；Tanon 4600SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠/化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取原料水果，等質(zhì)量比混勻，無菌水清潔表面，均勻切塊。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵情況與其他研究[7-9]選擇糖與物料的比例與發(fā)酵時(shí)間，將水果與紅糖以質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1（水果酵素A、B、C）加入滅菌發(fā)酵罐中，封口，自然發(fā)酵，分別在發(fā)酵0、30、60、90、120 d取樣，10 000 r/min離心10 min棄去沉淀，上清液即為水果酵素原液，-20 ℃條件下保存待測(cè)。

1.3.2 有機(jī)酸含量測(cè)定

待測(cè)樣品用5%氨水調(diào)節(jié)pH 8.2，經(jīng)SAX強(qiáng)陰離子柱純化。甲醇活化小柱，純凈水平衡，取0.5 mL調(diào)節(jié)pH值后的樣品過柱，控制流速1 mL/min，純凈水淋洗，6% HCl溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹，純凈水定容。樣品過0.45 μm微孔濾膜后用于高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件[10-11]：色譜柱為C18柱；流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH 2.7（用磷酸調(diào)節(jié)）；等梯度洗脫20 min；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長210 nm；檢測(cè)溫度30 ℃。

1.3.3 微生物多樣性分析

1.3.3.1 樣品總DNA擴(kuò)增

根據(jù)CTAB法[12]提取樣品中DNA。樣品細(xì)菌DNA經(jīng)過2 輪擴(kuò)增后進(jìn)行DGGE分析。首先使用F27和R1541對(duì)DNA全長片段嘗試第1輪擴(kuò)增，然后使用帶夾板的F338-GC和R518對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，用于DGGE分析。實(shí)驗(yàn)所用的引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers targeting bacteria and fungi used in this study

細(xì)菌PCR體系（50 μL）：25 μL Mix、20 μL ddH2O、2 μL F27（F338-GC）、2 μL R1541（R518）、1 μL模板。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。之后采用凝膠成像系統(tǒng)成像，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 DGGE與條帶測(cè)序

對(duì)樣品提取DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE檢測(cè)。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定變性劑梯度范圍25%～55%，Bisacrylamide為10%。兩種不同變性濃度的溶液，分別加入13 μL四甲基乙二胺和65 μL 10%過硫酸銨溶液，迅速混勻，灌膠。待膠凝固后加入電泳裝置，加入1×TAE緩沖液，緩沖液加熱至60 ℃，在每個(gè)加樣孔上樣25 μL，200 V預(yù)電泳5 min，之后調(diào)整電壓為120 V，電泳時(shí)間6 h。電泳結(jié)束后，取出膠板，去離子水清洗，加入固定液固定15 min，之后銀染、顯色、終止。使用凝膠成像儀觀察凝膠，并拍照記錄。采用Quantity One軟件標(biāo)記特異性條帶，并回收條帶，加入20 μL超純水，在4 ℃過夜溶解凝膠塊中的DNA。取5 μL凝膠浸出液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為不帶夾板的F338和R518（表1）。電泳檢測(cè)回收，由華大基因進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列同源性比對(duì)[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Quantity One讀取DGGE圖譜上條帶的數(shù)目與光密度值，并進(jìn)行UPMGA（非加權(quán)組平均算法）聚類分析，生成DGGE圖譜相似性分析圖，并根據(jù)DGGE數(shù)字化后的數(shù)據(jù)計(jì)算微生物多樣性指數(shù)，包括微生物多樣性指數(shù)、豐富度和均勻度指標(biāo)，其按 式（1）、（2）計(jì)算：

式中：H為Shannon-Wiener指數(shù)；S為PCR-DGGE膠中條帶數(shù)量（豐富度）；Pi為i條帶所占百分比；EH為均勻度指數(shù)。

參考于松峰等[17]的方法分別建立微生物豐度和有機(jī)酸的矩陣，微生物豐度數(shù)據(jù)使用百分比，利用Canoco for Windows 4.6 用于相關(guān)性分析。首先對(duì)物種數(shù)據(jù)進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（detrended correspondence analysis，DCA），根據(jù)每個(gè)排序軸的梯度長度對(duì)應(yīng)選擇單峰模型或線性模型，隨后對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的模型排序分析，研究微生物群落組成與其代謝產(chǎn)物中多種有機(jī)酸的相關(guān)性。其他數(shù)據(jù)顯著性分析使用SPSS 25.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸的測(cè)定結(jié)果

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）與樣品A 0 d（B）高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of organic acid standards (A) and organic acids in fermented fruits A (B)

如圖1所示，乳酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸是水果酵素中的主要有機(jī)酸，同時(shí)還含有少量的酒石酸、莽草酸和綠原酸，這與張思等[18]關(guān)于市售酵素的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)在16 種市售酵素中含量較多的主要是乳酸和檸檬酸。

圖2 水果酵素A、B、C在發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Fig. 2 Changes in organic acid contents in fermented fruits A, B and C during fermentation

如圖2所示，在發(fā)酵前后酵素中主要有機(jī)酸含量均發(fā)生變化。其中乳酸在有機(jī)酸中占比最高、變化最大，發(fā)酵0 d檢測(cè)到樣品A、B、C質(zhì)量濃度為2.92～3.70 mg/mL， 在發(fā)酵過程中先增大后減小，在發(fā)酵120 d質(zhì)量濃度為7.19～10.49 mg/mL。這可能由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值下降，而過低的pH值則會(huì)抑制乳酸菌的生長，此外，許多微生物可以在體內(nèi)代謝將乳酸降解[19]。檸檬酸占比次之，發(fā)酵120 d質(zhì)量濃度為5.79～7.93 mg/mL。乳酸菌可通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸，同時(shí)還可將檸檬酸分解產(chǎn)生乳酸。草酸、酒石酸、蘋果酸含量在發(fā)酵過程中下降，可能是菌群的代謝作用導(dǎo)致；蘋果酸含量在發(fā)酵90 d下降至0，是由于在發(fā)酵過程中乳酸菌可將蘋果酸降解為乳酸，并釋放CO2。水果酵素中莽草酸在發(fā)酵過程中含量增加，在發(fā)酵0、30 d未檢測(cè)到，但在發(fā)酵60、90、120 d檢測(cè)到質(zhì)量濃度在0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，這可能是微生物通過莽草酸途徑產(chǎn)生莽草酸；綠原酸質(zhì)量濃度約0.01 mg/mL，在檢測(cè)范圍內(nèi)無明顯變化規(guī)律。

此外，不同樣品在發(fā)酵不同階段有不同的有機(jī)酸變化，水果酵素A的草酸與檸檬酸在發(fā)酵30 d出現(xiàn)峰值，乳酸在發(fā)酵90 d出現(xiàn)峰值；水果酵素B的草酸與乳酸在發(fā)酵60 d出現(xiàn)峰值，檸檬酸在90 d含量最高；水果酵素C的草酸在發(fā)酵60 d出現(xiàn)最大值，在發(fā)酵90 d乳酸與檸檬酸出現(xiàn)最大值。不同糖與物料比的水果酵素在自然發(fā)酵過程中可以有針對(duì)性地選擇合適的發(fā)酵階段，保障酵素功能品質(zhì)。

2.2 水果酵素發(fā)酵過程中的微生物多樣性

2.2.1 PCR-DGGE分析

采用CTAB法提取水果酵素總DNA，測(cè)得A260nm/A280nm為1.79。以F27、R1541為引物進(jìn)行一輪擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示目標(biāo)條帶大小約為1 000 bp。以一輪PCR產(chǎn)物為模板，以F338-GC、R518為引物，對(duì)DNA中16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增分析，結(jié)果顯示目標(biāo)條帶約為200 bp。其PCR-DGGE圖譜見圖3。

圖3 水果酵素的細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜（A）及 條帶簡圖（B）Fig. 3 DGGE profile (A) and bands (B) of PCR-amplified 16S rDNA V3 regions from fermented fruits A, B and C

如圖3所示，每條泳道代表不同發(fā)酵時(shí)間的水果酵素細(xì)菌的DGGE圖譜，不同位置的條帶則代表不同種屬的微生物，條帶亮度反映微生物豐度高低，條帶數(shù)量代表菌落多樣性。由圖3可知，各條帶的遷移率及光密度值均有一定差異，可以判斷3 種水果酵素在發(fā)酵過程中細(xì)菌種類和含量均在不斷發(fā)生演替變化。如：條帶a、d在泳道4～8光密度值增加，可能是發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌；條帶m、o存在于泳道1、2、3中，說明對(duì)應(yīng)的菌可能是發(fā)酵前期的非優(yōu)勢(shì)菌種，在發(fā)酵后期被其他因素抑制以至消失；在16、17、18泳道上條帶數(shù)增加，菌種多樣性增加，后期發(fā)酵條件不適宜優(yōu)勢(shì)菌群繼續(xù)生長。

從18 份樣品的DGGE圖譜上共標(biāo)記出19 條特異性條帶，對(duì)條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，將檢測(cè)出的條帶序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果如表2所示。

表2 不同發(fā)酵階段的水果酵素樣品中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū) PCR-DGGE特異性條帶鑒定結(jié)果Table 2 Identification of PCR-DGGE bands of PCR-amplified bacterial 16S rDNA V3 regions from fermented fruits A, B and C through BLAST comparison with GenBank

由表2可知，在水果酵素樣品細(xì)菌DNA的DGGE圖譜上找到19 條特異性條帶，對(duì)其進(jìn)行分析的結(jié)果為：7 株乳酸菌，2 株瓊脂酶產(chǎn)生菌（Brevundimonassp.）， 2 株腸桿菌（Enterobacters p.）、1 株腸球菌（Enterococcussp.），2 株假單胞菌（Pseudomonassp.），以及3 株不可培養(yǎng)微生物，另外有2 株菌未檢測(cè)到。并且，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性均大于99%。條帶b、c、d、h、r的比對(duì)結(jié)果分別為乳酸乳球菌（L. lactissubsp.）2 株、短乳桿菌 （L. brevis）、植物乳桿菌（L. plantarum）和不可培養(yǎng)乳球菌（unculturedLactococcussp.），這些條帶出現(xiàn)在各發(fā)酵時(shí)間的樣品中。條帶i、j、k的比對(duì)結(jié)果分別是腸球菌（Enterococcussp.）、陰溝腸桿菌（E. cloacae）、不可培養(yǎng)微生物（uncultured bacterium），條帶m、o沒有比對(duì)出結(jié)果，可以再進(jìn)行進(jìn)一步的研究，這些條帶存在于樣品1、2、3中，即主要出現(xiàn)在發(fā)酵0 d的酵素中，此外條帶j、m也在發(fā)酵120 d酵素檢測(cè)到。條帶a、l、q分別為L. plantarum、香坊腸桿菌（E. xiangfangensis）和uncultured bacterium，主要出現(xiàn)在樣品4～14中。條帶e、g、n、p、s的比對(duì)結(jié)果分別為uncultured bacterium、Pseudomonassp.、Brevundimonassp.、不可培養(yǎng)嗜麥芽窄食單胞菌（unculturedStenotrophomonassp.）、不可培養(yǎng)瓊脂糖酶產(chǎn)生菌（unculturedBrevundimonassp.），主要存在于樣品15～18中，即發(fā)酵120 d的樣品。

本研究發(fā)現(xiàn)不同的糖與物料比影響水果酵素初始環(huán)境的滲透壓，也影響發(fā)酵過程中多種微生物群落的含量變化和優(yōu)勢(shì)菌群，因此在相同發(fā)酵階段，不同樣品的泳道條帶數(shù)與亮度存在異同。同一樣品在不同發(fā)酵階段的菌群變化也十分明顯。在第0天時(shí)L. lactissubsp.是水果酵素的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，它生長快速，代謝簡單，可分解碳水化合物生成乳酸，常見于植物產(chǎn)品和乳制品，其安全性被公認(rèn)[20]。L. brevis也在0 d出現(xiàn)，作為乳酸菌中重要的菌屬，常見于泡菜中[21]。Enterococcussp.、E. cloacae普遍存在于自然發(fā)酵初期，Kung等[22]曾在芥菜泡菜里分離到E. cloacae。在30～120 d發(fā)酵過程中，Enterococcussp.、E. cloacae條帶亮度減弱甚至消失。在發(fā)酵30 d時(shí)L. plantarum條帶變亮，含量增加。在發(fā)酵60、90、120 d的L. plantarum、L. lactissubsp.、L. brevis是該階段優(yōu)勢(shì)菌。Lactococcus與Lactobacillus以果糖和外源糖類作為碳源進(jìn)行代謝，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，使發(fā)酵液pH值下降，抑制雜菌生長。當(dāng)酵素發(fā)酵到150 d時(shí)，DGGE圖譜上條帶數(shù)量明顯變多，出現(xiàn)了Pseudomonassp.、Brevundimonassp.、Stenotrophomonassp.等腐敗菌，說明此時(shí)樣品中優(yōu)勢(shì)菌群已經(jīng)受到影響。Pseudomonassp.是嚴(yán)格好氧菌，在酸菜、腌制菜[23]中曾分離到，因此發(fā)酵過程中應(yīng)控制嚴(yán)格厭氧以減少污染。于美玲[24]對(duì)不同發(fā)酵階段的酸菜中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)明串珠菌在發(fā)酵前期占主導(dǎo)地位以啟動(dòng)酸菜發(fā)酵，L. coryniformis、L. fermentum和L. plantarum在發(fā)酵中期占有優(yōu)勢(shì)地位直至酸菜發(fā)酵成熟。本研究與其研究所涉及的微生物變化規(guī)律與熊濤等[25]研究結(jié)果相近，在自然發(fā)酵果蔬的過程中，異型乳酸發(fā)酵菌通常在發(fā)酵初期為優(yōu)勢(shì)菌群，有助于啟動(dòng)發(fā)酵，其產(chǎn)酸能力相對(duì)較弱。在發(fā)酵中后期，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的同型乳酸發(fā)酵菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2.2 PCR-DGGE結(jié)果聚類分析

如圖4所示，0 d與其他階段酵素的細(xì)菌菌群相似性較小，說明酵素在發(fā)酵后菌群變化較大；30 d后的水果酵素相似性較大，其中水果酵素B、C發(fā)酵30 d與60 d樣品較為接近，與0 d樣品具有較為明顯的差異，可能是由于水果酵素B、C在該階段有相似度較高的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。除此之外，水果酵素A在60 d與90 d的群落較為相近，可能是水果酵素A在發(fā)酵過程中的細(xì)菌菌群交替生長的結(jié)果。

圖4 水果酵素的細(xì)菌DGGE指紋圖譜聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of DGGE profiles for bacterial communities in different fermented fruits

2.2.3 細(xì)菌種群多樣性PCR-DGGE分析

由表3可知，不同樣品中細(xì)菌種群的均勻度較為接近，但是豐富度和多樣性指數(shù)差別較大。0 d時(shí)樣品具有較高的豐富度和多樣性，可能是由于發(fā)酵初期菌群不穩(wěn)定，微生物均為果蔬內(nèi)部或表皮攜帶的自然菌群；隨著發(fā)酵進(jìn)行，部分細(xì)菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，可以維持菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在發(fā)酵后期，泳道18（水果酵素C發(fā)酵150 d）中多樣性指數(shù)和豐度最高，分別為2.76和16.00，可能是由于該發(fā)酵階段優(yōu)勢(shì)菌群衰竭，也可能由于雜菌的污染。此結(jié)果和DGGE圖譜的直觀觀測(cè)結(jié)果一致。

表3 水果酵素細(xì)菌菌群多樣性分析Table 3 Analysis of bacterial community diversity in fermented fruits

2.3 相關(guān)性分析

為進(jìn)一步研究微生物群落變化與酵素內(nèi)有機(jī)酸含量變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系，首先對(duì)物種特征進(jìn)行了DCA，結(jié)果顯示物種數(shù)據(jù)適用于線性模型，即使用RDA更為準(zhǔn)確。RDA結(jié)果見表4，第1軸與第2軸特征值分別為0.396和0.150，微生物群落與有機(jī)酸的相關(guān)性分別為0.958和0.950，累積典范特征值為0.688，蒙特卡羅檢驗(yàn)值小于0.05，因此排序結(jié)果可以在一定程度上解釋微生物群落組成與環(huán)境有機(jī)酸含量之間的相互關(guān)系。

表4 RDA結(jié)果Table 4 Statistic data of RDA

圖5 微生物群落與有機(jī)酸變化RDAFig. 5 RDA of bacterial community and organic acids

從圖5可知，不同時(shí)期的樣品主要分布在3 個(gè)區(qū)域。發(fā)酵0 d的3 種酵素位置相對(duì)較為集中，分布在A區(qū)域，該區(qū)域分布的細(xì)菌包括unculturedbacterium（k）、unidentified（m）、Enterococcussp.（i）和unidentified（o），該區(qū)域的細(xì)菌對(duì)于酒石酸和蘋果酸的影響最大。B區(qū)域集中了大部分發(fā)酵30、60、90 d的酵素樣品，分布的細(xì)菌包括L. lactissubsp.（c）、L. plantarum（a）、E. xiangfangensis（l）、L. lactissubsp.（b）和L. brevis（d），該區(qū)域的細(xì)菌與草酸和綠原酸的相關(guān)性較高。C區(qū)域分布著發(fā)酵60 d之后的大部分酵素樣品，與乳酸、檸檬酸、莽草酸的相關(guān)性較高，分布在該區(qū)域的細(xì)菌有unculturedLactococcussp.（r）、unculturedbacterium（q）、L. plantarum（f）和unculturedStenotrophomonassp.（p）。

A區(qū)域集中了發(fā)酵前果蔬中自然存在的天然菌群，與30 d發(fā)酵后的酵素樣品相差較大，與酒石酸、蘋果酸呈正相關(guān)，與其他有機(jī)酸均呈負(fù)相關(guān)。B區(qū)域中，草酸與綠原酸向量夾角極小，說明在酵素發(fā)酵過程中，綠原酸和草酸相關(guān)性極強(qiáng)，是協(xié)同產(chǎn)生的。C區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)乳酸、檸檬酸、莽草酸向量夾角較小，推測(cè)是協(xié)同產(chǎn)生。此外，可以分析出對(duì)乳酸生成貢獻(xiàn)率較大的菌株（不可培養(yǎng)菌株菌不計(jì)算在內(nèi)）分別為：L. plantarum（a）＞L. plantarum（f）＞L.lactissubsp.（b）＞E. xiangfangensis（l）＞L. lactissubsp.（c）＞unculturedLactococcussp.（r）。產(chǎn)生乳酸的主要菌種主要是L. plantarum和L. lactis，這與其他文獻(xiàn)中乳酸的產(chǎn)生菌大體符合[25-27]，說明通過RDA分析方法探究酵素中微生物群落與有機(jī)酸之間的關(guān)系的結(jié)果是可信的。L. lactis和L. plantarum主要通過同型乳酸發(fā)酵方式產(chǎn)生乳酸，即葡萄糖通過糖酵解途徑降解形成丙酮酸，丙酮酸被乳酸脫氫酶催化還原生成乳酸。其中，L. lactis以產(chǎn)L-乳酸為主，植物乳桿菌則可產(chǎn)生DL-乳酸[28-29]。L. brevis則主要進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，除了產(chǎn)生乳酸以外，還可以產(chǎn)生少量的其他有機(jī)酸，如琥珀酸。與同型乳酸發(fā)酵菌相比，消耗等量的葡萄糖產(chǎn)生乳酸較少。因此，水果酵素在發(fā)酵前期乳酸菌通過代謝產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致pH值下降，總酸含量增加。在發(fā)酵后期，一方面葡萄糖作為主要的碳源基本被利用，另一方面體系的低pH值會(huì)對(duì)乳酸菌產(chǎn)生一定的抑制作用，從而導(dǎo)致乳酸菌代謝緩慢，因此乳酸含量的增加比前期較少。

從圖5還可分析出，對(duì)檸檬酸生成貢獻(xiàn)率較大的菌株分別為：L. plantarum（f）＞L. plantarum（a）＞unculturedBrevundimonassp.（s）＞E. xiangfangensis（l）＞ unculturedLactococcussp.（r）。水果酵素中的乳酸菌也可以對(duì)蘋果酸、檸檬酸進(jìn)行代謝，導(dǎo)致在發(fā)酵過程中蘋果酸含量下降，檸檬酸含量增加。熊濤等[26]在對(duì)傳統(tǒng)泡菜中有機(jī)酸含量的變化進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的變化規(guī)律，由于微生物的代謝作用，乳酸在發(fā)酵過程中穩(wěn)定增長，檸檬酸和蘋果酸含量均呈現(xiàn)先增加后下降最終保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用RDA方法對(duì)微生物在水果酵素發(fā)酵過程中微生物組成結(jié)構(gòu)變化與標(biāo)志性產(chǎn)物有機(jī)酸之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了研究，證實(shí)了RDA在微生物群落變化與有機(jī)酸相關(guān)性分析中的可行性，確定在發(fā)酵過程中與特征物質(zhì)生成與代謝有關(guān)的主要微生物，對(duì)闡明水果酵素發(fā)酵過程、指導(dǎo)水果酵素生產(chǎn)加工技術(shù)有重要參考價(jià)值。RDA表明對(duì)檸檬酸生成貢獻(xiàn)率較大的菌株分別為L. plantarum＞unculturedBrevundimonassp.＞E. xiangfangensis＞unculturedLactococcussp.，對(duì)乳酸生成貢獻(xiàn)率較大的菌株分別為L. plantarum＞L. lactissubsp.＞E. xiangfangensis＞L. lactissubsp.＞unculturedLactococcussp.。本研究得到有機(jī)酸與微生物群落共性變化規(guī)律，有助于以有機(jī)酸為指標(biāo)進(jìn)一步控制水果酵素中微生物發(fā)酵過程和品質(zhì)，切實(shí)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。