張煌，魯恒珍，周帥躍，鄭華理，朱愛萍

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率僅次于胃癌，嚴(yán)重威脅人民身體健康及生命安全。近年來，受飲食結(jié)構(gòu)、生活方式改變等諸多因素影響，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。結(jié)直腸癌早期發(fā)病癥狀隱匿，不易被察覺，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯過了最佳手術(shù)治療時機(jī)，導(dǎo)致患者5年生存率低、預(yù)后差[2]。尋找有效的輔助預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后并具有診斷價值的血清標(biāo)志物，對提高患者生存率、改善患者預(yù)后具有積極意義。微小RNA(microRNA，miR)是一類高度保守的非編碼小RNA，參與調(diào)節(jié)多種生理過程。因其在血液、尿液及腦脊液等體液中的穩(wěn)定性較好，miR已被證實具有成為多種疾病血清生物標(biāo)志物的潛能，也是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點[3]。miR-106b-5p具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等功能[4]；miR-30a-5p與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]，可能通過多種途徑發(fā)揮抑癌功能，但miR-106b-5p、miR-30a-5p在結(jié)直腸癌中的意義尚不十分明確?，F(xiàn)分析結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p檢測的應(yīng)用價值，為臨床提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月—2014年12月安徽省安慶市第一人民醫(yī)院腫瘤科手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者(結(jié)直腸癌組)、門診確診的結(jié)直腸腺瘤患者(結(jié)直腸腺瘤組)和同期健康體檢者(健康對照組)作為研究對象，各90例。結(jié)直腸癌組男53例，女37例，年齡42～73(45.13±7.58)歲，≤60歲56例，>60歲34例；腫瘤直徑：<5 cm 46例，≥5 cm 44例；腫瘤分化程度：中高分化 60例，低分化30例；腫瘤浸潤深度：T1+T2 57例，T3+T4 33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者57例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者33例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期25例。結(jié)直腸腺瘤組男49例，女41例，年齡41～74(44.98±6.95)歲，≤60歲54例，>60歲36例；患者均無惡性腫瘤、家族性息肉病及潰瘍性結(jié)腸炎等結(jié)直腸疾病。健康對照組男54例，女36例，年齡43～75(45.64±6.73)歲，≤60歲52例，>60歲38例；納入健康體檢者均無惡性腫瘤、肝腎疾病及其他嚴(yán)重疾病史。3組研究對象的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會核準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①完整的病歷資料及術(shù)后隨訪資料；②術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)確診；③卡氏(Karnofsky)評分≥70分。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)病例；②合并家族性腺瘤性息肉病；③合并胃癌等其他惡性腫瘤；④合并免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等疾??；⑤合并糖尿病等慢性疾病。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集： 結(jié)直腸癌組于術(shù)前1天、結(jié)直腸腺瘤組于確診后次日、健康對照組于體檢時，抽取所有研究對象的空腹外周靜脈血5 ml，在4℃時離心收集上層血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)檢測：血清樣本中加入cel-miR-39(終濃度500 fmol/ml，購自美國ABI公司)，RNA提取試劑盒(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)提取血清總RNA，微量紫外分光光度計(Nanodrop 1000，美國賽默飛世爾科技公司)檢測RNA濃度及純度，TaqMan miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miRNA特異性TaqMan miR試劑盒(美國ABI公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行TaqMan real-time PCR檢測；每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-△△Ct計算miRNA相對表達(dá)量。引物序列(由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計)如下，miR-106b-5p正向引物5’-TGCGGCAACACCAGTCGA TGG-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-30a-5p正向引物5’-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3’，miR-30a-5p反向引物5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3’；正向引物5’-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，內(nèi)參cel-miR-39反向引物5’-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平比較 血清miR-106b-5p相對表達(dá)量比較，結(jié)直腸癌組>結(jié)直腸腺瘤組>健康對照組(P均<0.01)；血清miR-30a-5p相對表達(dá)量比較，結(jié)直腸癌組<結(jié)直腸腺瘤組<健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 3組血清miR-106b-5p、miR-30a-5p相對表達(dá)水平比較

2.2 結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較 結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p水平在不同性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及浸潤深度方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

(P均>0.05)，而在不同腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；結(jié)直腸癌患者血清miR-30a-5p水平在不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，而在不同腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

2.3 結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平在不同預(yù)后情況中比較 以血清miR-106b-5p中位數(shù)(4.64)、miR-30a-5p中位數(shù)(0.39)分別為界，將結(jié)直腸癌患者分為高表達(dá)亞組(45例)和 低表達(dá)亞組(45例)，Kaplan-Meier結(jié)果顯示，血清miR-106b-5p高表達(dá)亞組患者術(shù)后5年總生存率為22.22%(10/45)，中位生存時間為(35.24±2.98)個月，低表達(dá)亞組為64.44%(29/45)，中位生存時間為(44.47±3.19)個月，2亞組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.449，P=0.001)，見圖1。血清miR-30a-5p高表達(dá)亞組患者術(shù)后5年總生存率為60.00%(27/45)，中位生存時間為(31.36±3.06)個月，低表達(dá)亞組為26.67%(12/45)，中位生存時間為(46.89±2.75)個月，2亞組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.613，P=0.000)，見圖1。

2.4 結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性 結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(r=-0.429，P=0.039), 血清miR-30a-5p表達(dá)水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)(r=0.458，P=0.041)。

表2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較

2.5 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的價值 ROC分析結(jié)果顯示，miR-106b-5p、miR-30a-5p診斷結(jié)直腸癌的cut-off值分別為4.52、0.39，AUC為0.785、0.692、0.824，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌的診斷價值較大，AUC為0.824，見表3，圖2。

3 討 論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中存在異常表達(dá)的miR分子，如高表達(dá)的miR-19a-3p和低表達(dá)的miR-874[6-7]，miR可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、浸潤、侵襲等活動，參與結(jié)直腸癌的癌變、病情進(jìn)展，且與結(jié)直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。癌胚抗原、糖類抗原19-9(CA19-9)等均是臨床上篩查結(jié)直腸癌的常用血清標(biāo)志物，但由于上述指標(biāo)在多種癌癥中亦有類似的變化，因此對患者預(yù)后預(yù)測特異性不高[10-12]。近年來，隨著miR研究深入，發(fā)現(xiàn)其不僅存在于細(xì)胞和組織中，在體液中也能穩(wěn)定表達(dá)，血清miR在腫瘤預(yù)后預(yù)測及輔助診斷等方面具有重要作用[13-15]。

有研究表明，miR-106b在胃癌中表達(dá)增加，且促進(jìn)細(xì)胞侵襲[16]，發(fā)揮促癌功能，本研究也證實結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p水平升高，且與腫瘤較大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較晚臨床分期密切關(guān)聯(lián)，與以往研究證實的miR-106b-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的結(jié)論一致[17-19]，而其他相關(guān)研究團(tuán)隊則認(rèn)

為miR-106b-5p表達(dá)降低，促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲[20]，以上研究結(jié)論相悖，筆者分析miR-106b呈現(xiàn)多種不同效應(yīng)，可能與不同研究體系有關(guān)，后續(xù)需要從分子生物學(xué)層面深入探究miR-106b-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲過程的具體調(diào)控機(jī)制，以支持本研究結(jié)論。

miR-30家族中的miR-30a包含miR-30a-3p和miR-30a-5p 2個亞型，分別來源于miR-30a前體莖環(huán)的3’端和5’端。目前對miR-30a-5p的研究，大多集中在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲方面，miR-30a-5p定位于人類6號染色體q13，除被證實可作為炎性因子外[21-23]，miR-30a-5p在不同類型腫瘤中表達(dá)趨勢并不一致，如在Li等[24]的研究中，miR-30a-5p通過調(diào)控Erk/Ets信號通路活性，抑制乳腺癌增殖、侵襲，而Jia等[25]發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p在膠質(zhì)瘤中具有促癌基因功能，可能與不同腫瘤具有特異分子生物機(jī)制有關(guān)，說明miR-30a-5p參與調(diào)控腫瘤的復(fù)雜性。目前關(guān)于miR-30a-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)意義的研究有限，本研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸腺瘤患者、健康體檢者相比，結(jié)直腸癌患者血清miR-30a-5p表達(dá)降低，結(jié)合患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，血清miR-30a-5p低表達(dá)與腫瘤組織低分化、較深浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較晚臨床分期關(guān)系緊密，上述結(jié)果表明miR-30a-5p低表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌癌變，并參與了腫瘤細(xì)胞去分化過程，如miR-30a-5p可通過作用于多種靶蛋白，對非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤EMT過程產(chǎn)生抑制作用[26]，而miR-30a-5p在結(jié)直腸癌中的分子調(diào)控機(jī)制，值得進(jìn)一步探究。

圖1 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平在結(jié)直腸癌患者不同預(yù)后中比較 圖2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌價值的ROC曲線圖

表3 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達(dá)水平對結(jié)直腸癌診斷價值的ROC分析

對結(jié)直腸癌患者而言，腫瘤細(xì)胞浸潤侵襲，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者病情惡化、生存率低、預(yù)后差的重要因素。根據(jù)患者術(shù)后隨訪資料，繪制Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)，血清miR-106b-5p高表達(dá)組、miR-30a-5p低表達(dá)組患者的預(yù)后均較差，術(shù)后5年生存率低且中位生存時間短，提示血清miR-106b-5p、miR-30a-5p可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物；ROC分析結(jié)果表明，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p對結(jié)直腸癌均有較高的診斷價值，且二指標(biāo)聯(lián)合檢測的敏感度、特異度明顯升高。活檢或術(shù)后的病理診斷是目前臨床上結(jié)直腸癌的主要診斷手段，同時輔以血清腫瘤標(biāo)志物檢測，本研究結(jié)果表明，血清miR-106b-5p，miR-30a-5p檢測可用于結(jié)直腸癌患者的輔助診斷，減少患者篩查結(jié)直腸癌的負(fù)擔(dān)。但鑒于本研究為單中心回顧性研究，樣本量小，存在一定局限性，研究結(jié)論有待進(jìn)一步證實。

綜上，結(jié)直腸癌患者血清miR-106b-5p呈現(xiàn)高表達(dá)、血清miR-30a-5p呈現(xiàn)低表達(dá)，且均與患者病情惡化進(jìn)展、不良預(yù)后相關(guān)，檢測血清miR-106b-5p、miR-30a-5p水平或可作為輔助結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測和診斷的有效手段。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張煌：提出研究方向、起草論文、撰寫論文；魯恒珍：數(shù)據(jù)收集和分析整理；周帥躍、鄭華理：實施研究過程，進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理；朱愛萍：設(shè)計研究方案、研究思路、研究選題、修訂論文、論文終審