巴赫，彭強，朱耀東

0 引言

胃癌是全球常見的腫瘤之一，其死亡率居第三位[1]。我國胃癌發(fā)病率超過20/10萬，是全球發(fā)病率最高的地區(qū)[2]。目前手術(shù)治療依舊是胃癌最主要的治療手段，根治術(shù)配伍化療可使早期胃癌患者5年生存率達到95%以上[3]。但由于胃癌早期癥狀隱匿且缺乏敏感度高、特異性強的早期篩查措施，約50%的患者被確診時已處于中晚期，錯失最佳的手術(shù)治療時機。抑癌基因失活在胃癌發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，探索其機制將對胃癌診斷和治療策略的開發(fā)具有重要意義。程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4,PDCD4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡水平發(fā)揮抑癌作用[4]。目前已在胃癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)PDCD4表達缺失[5-7]，但對其相關(guān)機制了解甚少。啟動子區(qū)高甲基化是抑癌基因表達缺失的常見原因，本研究中我們觀察了胃癌組織中PDCD4表達水平的變化及其與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性，并分析了啟動子高甲基化對PDCD4表達的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月—2019年9月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)根治術(shù)切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織各70例，其中男36例、女34例，年齡38～75歲，中位年齡為56歲。70例胃癌標本中，高、中分化42例、低分化28例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，根據(jù)TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期50例。同時取30例正常胃黏膜組織作為對照。癌旁組織均取自距離腫瘤邊緣3～6 cm處。所有患者及健康體檢者均得到本人或家屬的知情同意，并報我院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠PDCD4多克隆抗體購自美國Proteintech公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；光學顯微鏡購自日本Olympus；蛋白提取RIPA裂解液、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司；Western blot電泳儀購自美國伯樂公司；改良型BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；Western blot轉(zhuǎn)膜液、PVDF膜、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自日本Ta-KaRa公司；DNA甲基化修飾試劑盒購自德國Qiagen公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 HE染色

將胃癌及癌旁組織放入預(yù)先配好的固定液中進行固定。去除固定液，將固定好的組織用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切成4 μm薄片，而后進行HE染色，并在顯微鏡下分析記錄胃癌組織的分化程度、浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理指標。

1.4 免疫組織化學染色

取石蠟標本脫蠟水化，3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，5%山羊血室溫封閉后，滴加一抗，4℃孵育過夜，而后滴加二抗，37℃孵育30 min后，DAB顯色，蘇木精對比染色，脫水，中性樹膠封片。用已知PDCD4陽性切片作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。實驗結(jié)果判定：所有免疫組織化學染色結(jié)果均由2名病理科醫(yī)師通過雙盲法進行獨立評估。隨機選取5個高倍視野（×400）進行觀察。細胞著色強度：無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、黃褐色為3分。細胞著色數(shù)量：＜25%為0分、25%～50%為1分、≥50%～75%為2分、≥75%為3分。對細胞著色強度與著色數(shù)量的乘積進行計算，選取的5個視野中任一視野計分＞3分記為陽性，否則為陰性。

1.5 Western blot檢測PDCD4的表達

將組織樣本100 mg切碎研磨并放入組織勻漿器球狀部位后加入蛋白提取裂解液2 ml，放置于冰上30 min。2 000 r/min，離心30 min后，提取上清液1.5 ml至EP管中。通過BCA法對蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，并于4℃條件下進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜放于封閉液中，4℃封閉4 h，加入PDCD4及GAPGH一抗，4℃孵育過夜，再加入二抗，室溫孵育2 h。通過凝膠成像系統(tǒng)對目的蛋白以及內(nèi)參蛋白免疫印跡條帶進行灰度值分析。

1.6 MSP法檢測PDCD4基因CpG島甲基化水平

嚴格按照DNA提取試劑盒說明書對組織中DNA進行提取，將10 μl提取后的DNA加入EP管中，完成亞硫酸鹽修飾，并對DNA進行純化，將其濃度調(diào)整至適宜范圍，再使用甲基化引物進行PCR擴增。PDCD4甲基化引物通過MethPrimer軟件設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：5’-TCG TCG TTA CGA TTG GTT AGT C-3’和5’-GAA AAA TCT CTA ACC CTT CTC GC-3’。USP引物序列為5’-GGT TTT GTT GTT ATG ATT GGT TAG TT-3’和5’-CAA AAA ATC TCT AAC CCT TCT CAC T-3’。PCR 20 μl反應(yīng)體系包括：Taq酶0.5 μl、dNTP 0.5 μl、甲基化上游引物、下游引物各0.5 μl、10×Buffer 2 μl、亞硫酸鹽修飾后DNA模板2 μl以及水13 μl。體系配置好后放入PCR儀中進行PCR擴增。擴增結(jié)束后利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠掃描儀查看結(jié)果，擴增后得到非甲基化引物擴增產(chǎn)物為非甲基化（U），出現(xiàn)甲基化引物擴增產(chǎn)物為甲基化（M）。實驗中用經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶處理修飾DNA作為陽性對照，未處理者作為陰性對照，無DNA模板作為空白對照。甲基化程度=100/[1＋2(CtCG探針值-CtTG探針值)]，結(jié)果＜40為陽性。

1.7 RT-PCR檢測PDCD4 mRNA表達

通過TRIzol法提取標本中總RNA，通過分光光度計法檢測RNA的完整性，符合反轉(zhuǎn)錄實驗要求后，根據(jù)cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 30 min，98℃5 min，-20℃保存。以cDNA為模板，與基因特異性引物進行PCR擴增。擴增條件：94℃ 30 s，1個循環(huán)；94℃ 50 s、59℃ 30 s共40個循環(huán)；95℃ 2 s、60℃ 15 s、95℃ 2 s，一個循環(huán)，于50℃保存。對解離曲線進行分析，確定只有一種產(chǎn)物被擴增，再進行相對定量分析，結(jié)果以2-ΔΔCt表示，GAPDH為內(nèi)參基因[8]。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，卡方檢驗對PDCD4表達水平、PDCD4甲基化水平與臨床病理情況之間的關(guān)系進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中PDCD4表達

PDCD4主要表達于細胞質(zhì)，見圖1。其中胃癌組織中PDCD4表達陽性率（55.71%）較癌旁（88.57%）以及正常組織（96.67%）顯著下降（P＜0.05）；癌旁組織中PDCD4表達陽性率較正常胃黏膜組織有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。Western blot法檢測結(jié)果顯示胃癌組織中PDCD4表達顯著低于癌旁及正常組織（P＜0.05），見圖2。RT-PCR檢測結(jié)果顯示胃癌組織中PDCD4 mRNA表達水平顯著低于癌旁及正常組織（P＜0.05），見圖3。

2.2 胃癌組織中PDCD4啟動子區(qū)甲基化情況

MSP檢測結(jié)果顯示與癌旁（7.14%）及正常組織（0.00%）相比，胃癌組織（45.71%）中PDCD4基因啟動子甲基化顯著增強（P＜0.05）；癌旁組織中PDCD4甲基化程度較正常胃黏膜有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4、表1。

2.3 PDCD4蛋白表達及PDCD4甲基化水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4表達缺失與胃癌的分化、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），PDCD4啟動子高甲基化與胃癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.4 PDCD4甲基化水平與PDCD4蛋白及mRNA表達水平的相關(guān)性

圖1 胃癌、正常及癌旁組織中PDCD4蛋白表達(×200)Figure 1 PDCD4 protein expression in gastric cancer,normal and paracarcinoma tissues (×200)

表1 胃癌、癌旁及正常組織中PDCD4表達水平和甲基化情況 (n(%))Table 1 Expression and methylation of PDCD4 in gastric cancer,adjacent and normal tissues (n(%))

圖2 Western blot法檢測正常、癌旁以及胃癌組織中PDCD4表達情況Figure 2 Expression of PDCD4 in normal tissues,adjacent tissues and gastric cancer tissues detected by Western blot

以胃癌組織中PDCD4 mRNA相對表達量的中位數(shù)（1.76）將胃癌組織分為PDCD4 mRNA高表達組（＞1.76）和低表達組（＜1.76）各35例。對PDCD4蛋白表達、mRNA表達水平與PDCD4甲基化水平之間相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示PDCD4甲基化水平與PDCD4蛋白以及mRNA表達水平均呈負相關(guān)（P＜0.05），見表3。

3 討論

圖3 胃癌、癌旁及正常組織中PDCD4 mRNA表達Figure 3 PDCD4 mRNA expression in normal tissues,adjacent tissues and gastric cancer tissues

圖4 胃癌、癌旁以及正常組織中PDCD4啟動子甲基化情況Figure 4 Methylation of PDCD4 gene promoter in gastric cancer,adjacent and normal tissues

近幾十年來，雖然胃癌發(fā)病率持續(xù)下降，但依舊是最常見的腫瘤之一。由于胃癌的發(fā)病機制尚不清楚，且缺乏有效的早期診斷方法，對晚期胃癌難以取得理想的治療效果。抑癌基因表達缺失在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，深入探究其發(fā)生機制對胃癌的診治具有重要價值。PDCD4定位于人10q24染色體，可通過轉(zhuǎn)錄及翻譯階段調(diào)節(jié)與細胞增殖、凋亡相關(guān)的多種蛋白的表達起到抑制胃癌的作用[9]。PDCD4表達缺失已被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Tao等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-21可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PDCD4的表達，增強乳腺癌細胞的增殖能力和對紫杉醇的耐藥性；Dorrello等[10]發(fā)現(xiàn)S6K1可通過泛素依賴機制下調(diào)PDCD4的表達，促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。Zeng等[11]通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)PDCD4表達后有效抑制了宮頸癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力，并促進其發(fā)生凋亡。本研究通過免疫組織化學、Western blot以及RT-PCR法進行檢測，發(fā)現(xiàn)與癌旁以及正常組織相比，胃癌組織中PDCD4蛋白及mRNA表達水平均顯著下調(diào)。分析PDCD4表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PDCD4蛋白表達缺失與胃癌的分化、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與其他研究結(jié)果一致，表明PDCD4表達缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而其低表達可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后階段。

表2 PDCD4表達及甲基化水平與胃癌臨床病特征之間的相關(guān)性Table 2 Correlation of PDCD4 expression and methylation level with clinicopathological features of gastric cancer patients

表3 PDCD4啟動子甲基化水平與PDCD4蛋白及mRNA表達水平之間的相關(guān)性Table 3 Correlation of PDCD4 promoter methylation level with PDCD4 protein and mRNA expression levels

DNA甲基化是人體內(nèi)重要的表觀遺傳修飾途徑，其在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。啟動子CpG島甲基化通常會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受阻，是導(dǎo)致抑癌基因表達缺失的一種重要機制。Ding等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)5’CpG島高甲基化可能是肝癌中PDCD4蛋白和mRNA低表達的原因；Gao等[13]也通過研究證實啟動子高甲基化與PDCD4 mRNA表達缺失密切相關(guān)。本研究通過MSP法進行檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中PDCD4啟動子區(qū)甲基化水平顯著高于癌旁以及正常組織，且PDCD4高甲基化與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PDCD4甲基化水平與PDCD4蛋白及mRNA表達水平均呈負相關(guān)。與其他研究結(jié)果相符，表明PDCD4高甲基化與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且可能是PDCD4表達缺失的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中PDCD4表達顯著減弱，且與胃癌的分化、分期以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而啟動子區(qū)高甲基化可能是PDCD4表達缺失的原因。該研究結(jié)果表明PDCD4的甲基化水平以及表達水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對于胃癌的診斷以及臨床病理特征的評估具有參考意義。miR-21是與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的一種miRNA，并可下調(diào)PDCD4的表達[14-15]。下一步研究中，我們將觀察胃癌中miR-21對PDCD4啟動子甲基化水平的影響，以探究胃癌組織中PDCD4啟動子高甲基化的機制。