張馨丹，趙正剛，周素瑾，穆云萍，李美蓉，賴運(yùn)浩，蕭耿苗，李芳紅，趙子建

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）在惡性骨腫瘤中發(fā)病率最高，對(duì)0～24歲青少年危害最大，且其高發(fā)轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)展為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，5年生存率僅20%～30%[1]。目前盡管使用了一些新的治療方法如增加化療時(shí)間、提高藥物劑量或增加免疫治療，但均未取得較顯著的整體改善[2]。

VNP20009為沙門菌屬，是腫瘤靶向治療領(lǐng)域中研究最廣泛的細(xì)菌，具有較高安全性，目前已應(yīng)用于多種小鼠荷瘤模型中，如黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌等[3]。甲硫氨酸（Met）依賴性幾乎表現(xiàn)在所有惡性腫瘤細(xì)胞中，而正常細(xì)胞不存在Met依賴性[4]。甲硫氨酸酶（L-methioninase）可以特異性地將甲硫氨酸分解，但外源性給予有一定的不良反應(yīng)[5]。

本研究利用沙門氏菌的腫瘤靶向性以及骨肉瘤細(xì)胞甲硫氨酸代謝異常的特性，以VNP20009為載體，制備了高表達(dá)甲硫氨酸酶的減毒沙門氏菌VNP20009-M，利用代謝的手段在細(xì)胞和動(dòng)物水平評(píng)估VNP-M對(duì)骨肉瘤的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌與細(xì)胞株

VNP20009（YS1646）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。MNNG-HOS、U2OS、SaoS-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 質(zhì)粒、載體和酶活性

PSV-SPORT質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pRlenti-CAG-MCS-IRES2-EGFP，MEGL CDS質(zhì)粒購(gòu)自上海生工公司。通過電穿孔用質(zhì)粒PSV-SPORT或PSV-SPORT-L-methioninase轉(zhuǎn)染鼠傷寒沙門氏菌衍生物VNP20009，構(gòu)建對(duì)照菌株VNP20009-V（VNP-V）和目的菌株VNP20009-M（VNP-M）。甲硫氨酸酶活性的測(cè)定基于Sun等建立的方法[6]。

1.3 主要試劑與儀器

試劑：MEM、McCoy’s 5A、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；E.Z.N.A.Total RNA Kit Ⅰ購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自諾唯贊（南京） 公司；引物由上海生工生物有限公司合成；遷移小室 （24室直徑8.0 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

儀器：AC2-4S1型二級(jí)生物安全柜（ESCO，新加坡）；CLM-170B-8-NF型CO2培養(yǎng)箱（ESCO，新加坡）；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）；Leica倒置顯微鏡（Leica德國(guó)）；CMAXPLUS+酶標(biāo)儀（MD，美國(guó)）；-80℃冰箱（中國(guó)美菱公司）。

1.4 菌液PCR與質(zhì)粒PCR

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的VNP-V與VNP-M菌液各取1 μl稀釋于100 μl無菌超純水中，98℃金屬浴5 min作為菌液PCR模板；按照質(zhì)粒中提試劑盒（Thermo Fisher K210005）說明書抽提生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的VNP-V與VNP-M質(zhì)粒，并稀釋至1 ng/μl作為質(zhì)粒PCR模板；PCR試劑盒（中國(guó)南京諾唯贊生物科技有限公司P131-03）。

1.5 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)

MNNG-HOS細(xì)胞培養(yǎng)在含MEM和10%FBS的培養(yǎng)基中，Saos-2細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy’s 5A+20%FBS的培養(yǎng)基中，U2OS細(xì)胞培養(yǎng)于Mc-Coy’s 5A+10%FBS的培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.6 骨肉瘤細(xì)胞凋亡、增殖和遷移能力檢測(cè)

將骨肉瘤細(xì)胞與對(duì)照菌株和攜帶甲硫氨酸酶的目的菌株于37℃共培養(yǎng)4 h，PBS洗滌后置于補(bǔ)充有鏈霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD 556547）檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果；CCK-8測(cè)定法測(cè)量癌細(xì)胞活力；將細(xì)胞接種至Transwell上室，下室中20%FBS作為吸引劑，用棉簽去除非侵入細(xì)胞，結(jié)晶紫染色入侵細(xì)胞，顯微鏡拍攝圖像并定量。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

提取細(xì)胞總RNA使用Vazyme（中國(guó)）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)RNA得到cDNA，隨后以反轉(zhuǎn)cDNA為模版，加入Power SYBR Green PCR Master Mix以及相應(yīng)基因引物對(duì)目的基因進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 30 s，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)。引物核酸序列為:MEGL-F:5’-ATGCGCGACTCCCATAAC-3’;MEGL-R:5’-TCATGCACACACGCCTCCAA-3’。

1.8 病理學(xué)分析

使用10%福爾馬林固定腫瘤組織，石蠟包埋，蘇木精和伊紅（H＆E）染色，Nikon顯微鏡拍攝圖像。

1.9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞

利用對(duì)照質(zhì)粒pRlenti-CAG-MCS-IRES2-EGFP（EGFP）與攜帶甲硫氨酸酶基因的目的質(zhì)粒：MEGL CDS（MEGL）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，得到對(duì)照組（EGFP）與高表達(dá)甲硫氨酸酶基因的實(shí)驗(yàn)組（MEGL），同時(shí)實(shí)驗(yàn)使用PBS代替轉(zhuǎn)染試劑設(shè)置完全對(duì)照組（CON）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天以每室2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至40%～60%后準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；使用賽默飛（中國(guó)）Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑。將配置好的轉(zhuǎn)染試劑加入6孔板中，輕輕晃動(dòng)，使脂質(zhì)體混合均勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

6～7周齡的雌性無胸腺裸鼠（BALB/c nu/nu）購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格遵循廣東藥科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)（批號(hào)：GOPUSPF2017048）制定的動(dòng)物護(hù)理方針。接種之前，胰蛋白酶消化收獲腫瘤細(xì)胞，并通過細(xì)胞過濾器去除細(xì)胞聚集體，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并稀釋至6.5×104/μl PBS中進(jìn)行皮下接種。

實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)：待腫瘤體積達(dá)到60～80 mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。采用瘤內(nèi)注射方式給藥一次。低劑量組分別注射濃度為2×103cfu/μl PBS的兩種基因工程菌；高劑量組分別注射濃度為2×105cfu/μl PBS的兩種基因工程菌；完全對(duì)照組注射10 μl PBS。隨后連續(xù)測(cè)量小鼠體質(zhì)量，觀察其活動(dòng)狀態(tài)并定期通過游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除了圖注中指出采用特殊的統(tǒng)計(jì)方法以外，兩兩之間比較采用雙尾Student’st檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析和Tukey’s檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建表達(dá)甲硫氨酸酶的基因工程菌VNP-M

菌液PCR與質(zhì)粒PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VNP-M的菌液和質(zhì)粒在1 200 bp處有特異性條帶（甲硫氨酸酶基因L-methioninase全長(zhǎng)1 200 bp），攜帶甲硫氨酸酶基因的基因工程菌構(gòu)建成功，見圖1A。與目的基因（L-methioninase）比對(duì)，VNP-M中的甲硫氨酸酶基因序列測(cè)序正確。比色法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，VNP-M甲硫氨酸酶的活性顯著高于VNP-V（P＜0.001），見圖1B。

2.2 VNP-M促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡

結(jié)果顯示，VNP-M與VNP-V均可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，且VNP-M促凋亡效果更顯著（Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞比例為：VNP-V:VNP-M 為13.39% :56.19%），見圖2。

圖1 VNP20009-M菌株中甲硫氨酸酶基因及活性檢測(cè)Figure 1 Detection of methioninase gene and activity in VNP20009-M

2.3 過表達(dá)甲硫氨酸酶顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移能力

高表達(dá)甲硫氨酸酶基因能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞株MNNG-HOS的增殖能力，見圖3；高表達(dá)甲硫氨酸酶顯著抑制MNNG-HOS、U2OS及SaoS-2細(xì)胞的遷移能力，見圖4。

2.4 VNP-M抑制骨肉瘤異種移植瘤生長(zhǎng)

骨肉瘤皮下異種移植瘤模型瘤內(nèi)分別給予高低劑量藥物后，荷瘤鼠的活動(dòng)、進(jìn)食無明顯差別，體質(zhì)量呈穩(wěn)定趨勢(shì)。

與對(duì)照組相比，VNP-V及VNP-M低劑量組小鼠腫瘤體積均無顯著性差異，見圖5A～B；而VNP-M高劑量治療后，骨肉瘤生長(zhǎng)速度明顯放緩（P＜0.01），見圖5C～D，其瘤體重量約為對(duì)照組的1/3。給藥治療10天后，高劑量VNP-M治療后腫瘤體積與瘤重均顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)較高濃度VNP-M能夠有效抑制在體骨肉瘤的生長(zhǎng)。

3 討論

圖2 VNP20009-M對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of VNP20009-M on apoptosis of osteosarcoma cells

圖3 過表達(dá)甲硫氨酸酶對(duì)MNNG-HOS細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of methioninase overexpression on proliferation of MNNG-HOS cells

甲硫氨酸依賴性地存在于絕大部分腫瘤細(xì)胞內(nèi)[7]，已有研究表明在患者飲食中限制甲硫氨酸的攝入可以有效減少包括胰腺癌、腎癌等腫瘤的生長(zhǎng)[5]，但長(zhǎng)期的甲硫氨酸缺失在一定程度上會(huì)造成患者營(yíng)養(yǎng)不良，反而加重病情。有研究證明通過腹腔注射重組甲硫氨酸酶能有效遏制裸鼠吉田肉瘤與肺部腫瘤[8]，但由于哺乳動(dòng)物本身不表達(dá)甲硫氨酸酶，外源性地給予甲硫氨酸酶具有一定風(fēng)險(xiǎn)[9]。早在1868年，德國(guó)醫(yī)生Busch首次使用化膿性鏈球菌感染惡性肉瘤患者，并得到一定的治療效果。而后德國(guó)醫(yī)生Fehleisen和美國(guó)醫(yī)生William B.Coley先后報(bào)道了利用化膿性鏈球菌完全治愈惡性肉瘤患者的病例[10]。目前腫瘤的細(xì)菌療法已經(jīng)成為研究熱門，其中減毒沙門氏菌VNP20009是迄今為止靶向腫瘤領(lǐng)域中研究最廣泛的細(xì)菌[11]，具有出色的安全性，包括遺傳減毒力（purI基因缺失）、敗血性休克潛力降低（msbB基因缺失）和抗生素敏感度[12]。在對(duì)日本40例原發(fā)性骨肉瘤患者腫瘤組織研究后發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者普遍缺乏甲硫腺苷磷酸化酶（一種甲硫氨酸補(bǔ)償途徑中重要的激酶，用于內(nèi)源性合成甲硫氨酸）[13]，這意味著骨肉瘤患者相比健康人群來說更依賴于外源性甲硫氨酸的補(bǔ)給。

圖4 過表達(dá)甲硫氨酸酶對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of methioninase overexpression on migration ability of osteosarcoma cells

圖5 基因工程菌治療對(duì)小鼠腫瘤體積和瘤重的影響Figure 5 Effect of genetically engineered bacteria treatment on tumor volume and tumor weight in mice

本研究使用基因工程手段，利用微生物載體攜帶特異性消耗甲硫氨酸的酶構(gòu)建VNP20009-M，通過阻斷氨基酸的需求以達(dá)到殺傷腫瘤和阻斷擴(kuò)散的目的。為了進(jìn)一步研究，我們選用的骨肉瘤細(xì)胞系MNNG-HOS、SaoS-2及U2OS均屬于惡性程度高且在臨床上缺乏有效藥物的腫瘤細(xì)胞，以這三種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，并用MNNG-HOS建立裸鼠皮下荷瘤模型來評(píng)估VNP20009-M對(duì)骨肉瘤的治療作用及其機(jī)制。VNP-M與骨肉瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出較好的促凋亡作用。為了進(jìn)一步研究VNP-M對(duì)骨肉瘤治療作用的機(jī)制，我們?cè)诓煌墓侨饬黾?xì)胞系里過表達(dá)甲硫氨酸酶基因，結(jié)果顯示細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移均顯著受到抑制，提示VNP-M可能通過表達(dá)甲硫氨酸酶來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖遷移能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過瘤內(nèi)注射不同劑量的VNP-M來治療骨肉瘤皮下腫瘤，接受低劑量VNP-M治療的小鼠腫瘤體積跟VNP-V和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而較高劑量VNP-M治療后小鼠腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制，表明VNP-M對(duì)骨肉瘤的治療作用可能具有劑量依賴性。骨肉瘤預(yù)后不良和高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)，Wang等[14]指出剝奪甲硫氨酸對(duì)腫瘤干細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，提示VNP-M可能對(duì)阻斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移有潛在的效果。后續(xù)工作中，我們將研究VNP-M影響骨肉瘤細(xì)胞及小鼠腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步模擬真實(shí)的發(fā)病情況，如構(gòu)建尾靜脈全身轉(zhuǎn)移模型與原位轉(zhuǎn)移模型來探索VNP-M的治療效果及其分子機(jī)制。

綜上所述，本研究利用減毒沙門氏菌作為載體攜帶甲硫氨酸酶基因，在體內(nèi)靶向腫瘤并表達(dá)高活性的甲硫氨酸酶基因，在破壞腫瘤微環(huán)境激活腫瘤局部免疫反應(yīng)的同時(shí)，特異性消耗腫瘤內(nèi)部的甲硫氨酸水平。VNP20009-M在體外可明顯誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移能力，在體內(nèi)可明顯抑制骨肉瘤生長(zhǎng)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。