閆思遠(yuǎn)， 王小利， 杜娟， 顧沛雯

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)引起的一種世界性病害[1]。該病是一種典型的流行性病害，病菌從侵入到發(fā)病僅需要3 ～ 5 d[2]。在條件適宜時(shí)，從田間出現(xiàn)中心病株到全田普發(fā)，僅需10 ～ 15 d[3]。葡萄霜霉病菌是一種活體營養(yǎng)專性寄生菌，無法人工培養(yǎng)，這在一定程度上影響了對(duì)該菌的早期診斷、監(jiān)測(cè)、群體遺傳分化等方面的深入研究[4]。傳統(tǒng)的病原菌分離鑒定方法比較繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)早期快速準(zhǔn)確診斷，給病害監(jiān)測(cè)和防控工作帶來一定困難[5]。因此，建立簡(jiǎn)便、快捷和準(zhǔn)確的早期監(jiān)測(cè)技術(shù)尤為重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是由Notomi在2000年開發(fā)出的一種新型的在恒溫條件下快速完成靶標(biāo)基因擴(kuò)增的新方法[6]。該方法利用1對(duì)內(nèi)引物FIP/BIP和1對(duì)外引物F3/B3，在具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶的作用下，于恒溫條件下催化新鏈的合成，從而實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增的目的[7]。LAMP反應(yīng)過程包括3個(gè)階段，分別為啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、延伸和再循環(huán)階段，最終形成大小不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，使得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)梯形條帶[8]。LAMP技術(shù)自發(fā)明以來，就被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒和線蟲等病原體的檢測(cè)[9]。黃雯等[10]建立了青枯菌(Ralstoniasolanacearum)LAMP體系，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為青枯病在田間的快速精準(zhǔn)診斷、植物繁殖材料帶菌檢測(cè)以及病害的防控效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。曾丹丹等[11]建立了水稻擬輪枝鐮孢(Fusariumverticillioides)的LAMP檢測(cè)體系，用于江蘇南京和鎮(zhèn)江地區(qū)疑似水稻惡苗病的快速診斷。FERRARA等[12]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)能夠產(chǎn)生伏馬毒素的黑曲霉(Asperigillusniger)和(A.welwitschiae)，為有效減少玉米中曲霉毒素的污染提供了依據(jù)。本研究根據(jù)葡萄霜霉病菌ITS的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，通過優(yōu)化擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，鑒定方法的特異性、靈敏性和實(shí)用性，構(gòu)建葡萄霜霉病菌LAMP檢測(cè)技術(shù)體系，以期為葡萄霜霉病菌的早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供一種切實(shí)可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

14種葡萄及其他作物病原菌(表1)經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析進(jìn)行菌株鑒定，保存于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室。

表1 供試菌株

1.2 主要儀器與試劑

Simpli Nano超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare公司，美國)；Sigma 3K 15通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Sigma公司，美國)；T 100TM Thermal Cycler PCR儀(Bio Rad公司，美國)；電泳儀(北京六一廠)；Azure c200凝膠成像系統(tǒng)(Azure Biosystems公司，美國)；Blook藍(lán)光透照儀(Genedirex臺(tái)灣德怡科技有限公司)；Mettler-toledo LE204E電子分析天平(Mettler-toledo公司，瑞士)。

真菌DNA提取試劑盒(Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux公司，日本)；植物DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?HP Plant DNA Mini Kit，Omega Bio-tek公司，美國)；Bst DNA polymerase(New England Biolabs公司，美國)；Betaine(上海生工生物工程有限公司)；SYBR Green I(上海瑞楚生物公司)；100 bp DNA Ladder(北京全式金公司)；dNTP Mixture(BBI生命科學(xué)有限公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

使用Primer Premier 6.0，根據(jù)GenBank中葡萄霜霉病菌(登錄號(hào)：DQ665668和登錄號(hào)DQ665666)、葡萄白粉菌(登錄號(hào)：LC028995和登錄號(hào)：KJ539202)和葡萄灰霉菌(登錄號(hào)：KX443701)的rDNA-ITS的序列信息，進(jìn)行序列比對(duì)。以葡萄霜霉菌rDNA-ITS(登錄號(hào)：DQ665668)全長(zhǎng)序列(2 337 bp)，采用Primer Explore V4設(shè)計(jì)LAMP引物，根據(jù)引物長(zhǎng)度、引物自由能及GC含量等篩選，獲得7對(duì)LAMP引物，序列如表2所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表2 本研究所用的LAMP引物

1.4 樣品DNA提取

使用Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit提取14種真菌菌絲體DNA(表1)。使用3?HP Plant DNA Mini Kit提取葡萄葉片DNA，分別于-80 ℃保存，備用。

1.5 LAMP引物初篩

參照KONG等[13]的方法建立LAMP反應(yīng)體系，并略作調(diào)整。1 μL DNA模板，10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1的MgCl26 μL；8 U·μL-1Bst DNA polymerase 1 μL；5 mol·L-1甜菜堿5 μL；10 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL；50 μmol·L-1FIP/BIP 0.7 μL；20 μmol·L-1F3/B3 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)條件為：65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增60 min。利用上述反應(yīng)體系以葡萄霜霉病菌DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，對(duì)7對(duì)引物進(jìn)行篩選。反應(yīng)結(jié)果通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。

1.6 LAMP引物特異性檢查

使用篩選出的引物對(duì)上述(表1)提取的14種真菌DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以ddH2O為空白對(duì)照，以健康葡萄葉片DNA為陰性對(duì)照，檢測(cè)引物特異性。反應(yīng)結(jié)果通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。

1.7 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

按照1.4的方法，分別考察Bst DNA聚合酶含量(終含量變化為0.192～0.512 U·μL-1)，反應(yīng)溫度(反應(yīng)溫度變化范圍為58～66 ℃)，反應(yīng)時(shí)間(30～75 min)對(duì)LAMP的影響，以ddH2O為空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)果通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。

1.8 LAMP體系靈敏度測(cè)定

將葡萄霜霉菌DNA質(zhì)量濃度分別稀釋為1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 ng·μL-1。使用優(yōu)化后的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)所建立的體系對(duì)于葡萄霜霉病菌DNA檢測(cè)的靈敏度。反應(yīng)結(jié)果通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)或加入SYBR Green I熒光染液在自然光和藍(lán)光儀觀察顏色變化(嫩綠色、有熒光為陽性；橙紅色、無熒光為陰性)。

1.9 田間葡萄霜霉病樣品檢測(cè)

2019-08-15，在寧夏新惠彬酒莊、賀蘭神酒莊、酩悅軒尼詩夏桐(寧夏)酒莊、張?jiān)Ｄθ麪柺迨谰魄f等4個(gè)酒莊葡萄園采集病葉，以葡萄無菌組培苗為對(duì)照。按照1.4的方法提取葡萄葉片總DNA，使用優(yōu)化后的LAMP體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)或加入SYBR Green I熒光染液在自然光和藍(lán)光儀觀察顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

以葡萄霜霉病菌DNA為模板，對(duì)7對(duì)引物進(jìn)行篩選，如圖1所示，只有引物Pv-LAMP-1和Pv-LAMP-2能夠擴(kuò)增出梯狀條帶，其他引物均無條帶出現(xiàn)。

M：Marker；1～7：引物Pv-LAMP-1～Pv-LAMP-7。

2.2 引物特異性檢測(cè)

使用LAMP引物Pv-LAMP-1和Pv-LAMP-2分別對(duì)葡萄霜霉病菌、辣椒炭疽病菌和葡萄灰霉病菌等14種植物病原真菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。如圖2所示，引物Pv-LAMP-1能夠檢測(cè)來源于鮮食葡萄(紅地球)和釀酒葡萄(霞多麗)的葡萄霜霉病菌，而其他供試菌DNA，健康葡萄葉片DNA以及清水對(duì)照均不能擴(kuò)增出梯狀條帶。引物Pv-LAMP-2能夠擴(kuò)增出葡萄霜霉病菌、葡萄白粉病菌和西葫蘆白粉病菌，對(duì)葡萄霜霉病菌沒有特異性。因此，選擇引物Pv-LAMP-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

A：Pv-LAMP-1；B：Pv-LAMP-2。

2.3 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)LAMP反應(yīng)條件如Bst DNA聚合酶含量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

當(dāng)體系中Bst DNA聚合酶含量為0.32 U·μL-1時(shí)梯狀條帶最清晰，而在其他含量的時(shí)候亮度雖高，但清晰度較差，因此反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶最佳含量為0.32 U·μL-1(圖3-A)。

當(dāng)溫度為58 ℃的時(shí)候，無條帶出現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ～ 66 ℃時(shí)均可擴(kuò)增出梯狀條帶。當(dāng)溫度高于62 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，條帶亮度增強(qiáng)而清晰度減弱。因此，選取62 ℃為L(zhǎng)AMP的最佳反應(yīng)溫度(圖3-B)。

如圖3-C所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)無條帶出現(xiàn)，即30 min不足以產(chǎn)生電泳能夠檢測(cè)到的目的條帶；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)有條帶顯現(xiàn)但條帶亮度較差；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為75 min時(shí)，有條帶顯現(xiàn)但條帶亮度較高，清晰度較差；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，條帶的亮度與清晰度均為最佳。因此，LAMP檢測(cè)最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

A：Bst DNA聚合酶對(duì)LAMP檢測(cè)的影響(M：Marker；1：0.192 U·μL-1；2：0.256 U·μL-1；3：0.320 U·μL-1；4：0.384 U·μL-1；5：0.448 U·μL-1；6：0.512 U·μL-1)；B：反應(yīng)溫度對(duì)LAMP檢測(cè)的影響(M：Marker；1：58 ℃；2：60 ℃；3：62 ℃；4：64 ℃；5：66 ℃)；C：反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP檢測(cè)的影響(M：Marker；1：30 min；2：45 min；3：60 min；4：75 min)。

2.4 LAMP靈敏度檢測(cè)

對(duì)優(yōu)化后的LAMP體系進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果表明優(yōu)化后的LAMP體系的檢測(cè)靈敏度為0.3 ng·μL-1(圖4-A)。通過SYBR Green Ι熒光染液染色，當(dāng)模板質(zhì)量濃度低于0.3 ng·μL-1時(shí)，加入染色劑，反應(yīng)底物顏色為橙紅色，當(dāng)模板質(zhì)量濃度大于0.3 ng·μL-1時(shí)，隨著DNA模板濃度的增加，綠色的深度逐漸遞增，在藍(lán)光儀下的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)(圖4-B、C)。

A：LAMP靈敏度檢測(cè)；B：自然光下SYBR Green Ⅰ熒光染液檢測(cè)；C：藍(lán)光下SYBR Green Ⅰ熒光染液檢測(cè)。

2.5 田間葡萄霜霉病的LAMP檢測(cè)

從寧夏新惠彬酒莊、賀蘭神酒莊、酩悅軒尼詩夏桐(寧夏)酒莊、張?jiān)Ｄθ麪柺迨谰魄f采集病葉，提取葉片DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示，不同來源的葡萄霜霉病葉均能使用所建立的LAMP體系擴(kuò)增出梯狀條帶，準(zhǔn)確率高達(dá)100%。使用SYBR Green Ι熒光染液對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行染色，呈現(xiàn)出與電泳相同的結(jié)果。

A：LAMP檢測(cè)；B：自然光下SYBR Green Ⅰ熒光染液檢測(cè)；C：藍(lán)光下SYBR Green Ⅰ熒光染液檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)是準(zhǔn)確防控葡萄霜霉病、減少農(nóng)藥使用和精準(zhǔn)施用的關(guān)鍵。因此，開展葡萄霜霉病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)研究，對(duì)于科學(xué)防治葡萄霜霉病具有重要意義[14-15]。分子檢測(cè)技術(shù)是作為預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的重要手段，可為精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供了分子技術(shù)方案。目前，關(guān)于葡萄霜霉病菌的快速分子檢測(cè)方法的報(bào)道很少。秦文韜等[16]利用葡萄霜霉病菌細(xì)胞色素C氧化酶亞型2(cytochromecoxidase Ⅱ，Cox2)，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性檢測(cè)引物F-Pv/R-Pv，建立了葡萄霜霉病菌常規(guī)PCR檢測(cè)體系，并對(duì)78份國內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的葡萄霜霉病樣品進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確率高達(dá)100%。李文學(xué)等[17]利用Cox2基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物F-cox-Pv/R-Pv，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，并對(duì)人工接種葡萄霜霉病菌的潛伏期葉片內(nèi)病原菌DNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。常規(guī)PCR檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，除了需要設(shè)計(jì)特異性引物，檢測(cè)必須在特定的儀器、程序和擴(kuò)增條件下完成，耗時(shí)、耗力且檢測(cè)成本高。LAMP技術(shù)依賴4條特異引物(包括正向外引物、正向內(nèi)引物、反向外引物和反向內(nèi)引物)和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏的擴(kuò)增序列[18]。該方法操作簡(jiǎn)單，恒溫條件下，一步擴(kuò)增就可以完成樣品檢測(cè)，使檢測(cè)周期大幅度縮短，降低檢測(cè)成本[19]。

國內(nèi)有關(guān)葡萄霜霉病的LAMP檢測(cè)體系的建立文獻(xiàn)較少，僅秦文韜[15]利用1對(duì)內(nèi)引物FIP/BIP和1對(duì)外引物F3/B3外加1條環(huán)引物L(fēng)B建立了葡萄霜霉病的檢測(cè)體系，用于鮮食葡萄霜霉病的檢測(cè)鑒定。筆者前期使用秦文韜設(shè)計(jì)的引物用于檢測(cè)釀酒葡萄霜霉病，未擴(kuò)增出目的條帶。本研究根據(jù)葡萄霜霉病ITS序列設(shè)計(jì)了1對(duì)內(nèi)引物和1對(duì)外引物建立了葡萄霜霉病菌LAMP檢測(cè)體系，能分別檢測(cè)到被葡萄霜霉病菌感染的釀酒葡萄和鮮食葡萄樣品；此外，相對(duì)于秦文韜建立的檢測(cè)體系減少了1～2條環(huán)引物的設(shè)計(jì)，而靈敏度幾乎一致，從而降低了引物合成成本，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。

Bst DNA聚合酶是一種鏈置換的DNA聚合酶[18]，不同來源的Bst DNA聚合酶都有其最適量、最適宜反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的組合，需要針對(duì)不同DNA樣品、LAMP引物和反應(yīng)條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化。本研究最終獲得LAMP最佳反應(yīng)條件為以PVITF3-1/PVITB3-1外引物，PVITFIP-1/PVITBIP-1為內(nèi)引物，反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶含量為0.32 U·μL-1，在62 ℃反應(yīng)60 min，一步擴(kuò)增完成，靈敏度為0.3 ng·μL-1，適合于鮮食葡萄和糖度較高的釀酒葡萄樣品檢測(cè)，且反應(yīng)穩(wěn)定。甚至在缺少PCR儀的情況下，利用金屬浴等恒溫設(shè)備也可以完成反應(yīng)。此外，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物除采用電泳外，染色劑染色也可以確定待測(cè)樣品是否感染葡萄霜霉病菌，具有易操作、快速、靈敏、高度特異性等特點(diǎn)，適于葡萄產(chǎn)區(qū)、企業(yè)等基層技術(shù)部門進(jìn)行葡萄霜霉病菌的快速檢測(cè)，具有實(shí)用性和推廣價(jià)值。