居勵之，林赟霄，吳 瓊，曹 敏，彭瓏萍，董藝丹，張成輝，施錦繡，王佑華

老齡化已經(jīng)成為當(dāng)今社會的嚴(yán)峻問題[1]，而原發(fā)性高血壓病嚴(yán)重威脅我國老年人群的身體健康[2]。高脂血癥是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，研究發(fā)現(xiàn)，高血壓病和高脂血癥往往互相影響、互相伴隨[3]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是人體中重要的載脂蛋白[4]，其基因多態(tài)性及高脂血癥與老年人血壓密切相關(guān)[5-6]。證候是疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，近年來，有學(xué)者開展了大量基因型與中醫(yī)證候相關(guān)性的研究，但基因型與中醫(yī)證型及臨床表型之間聯(lián)合分析的研究尚待深入。本課題組研究上海市某社區(qū)高血壓病人群，發(fā)現(xiàn) rs1800871基因多態(tài)性與老年高血壓中醫(yī)證型相關(guān)，與老年男性高血壓病虛實(shí)辨證相關(guān)[6]。本研究擬運(yùn)用二代測序技術(shù)檢測ApoE基因，探討ApoE基因型與老年男性高血壓病病人中醫(yī)證型及血脂的相關(guān)性，探索高血壓病病人中醫(yī)證型與血脂表型的遺傳基礎(chǔ)，尋找診斷評估的新切入點(diǎn)，以期為臨床辨治高血壓病提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年—2017年在上海某社區(qū)體檢的老年男性高血壓病病人284例，年齡65～85(73.84±5.70)歲，其中腎氣虧虛證53例，肝火亢盛證87例，痰瘀互結(jié)證67例，陰虛陽亢證78例。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國高血壓防治指南》修訂委員會制定的《中國高血壓防治指南(2010年修訂版)》[7]及《中國成人血脂異常防治指南制定聯(lián)合委員會》制定的《中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》[8]高血壓及血脂異常標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)參照《眩暈(原發(fā)性高血壓)中醫(yī)診療方案》(國家中醫(yī)藥管理局高血壓國家中醫(yī)臨床基地)及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(國家藥品監(jiān)督管理局)[9]分為肝火亢盛型、痰瘀互結(jié)型、陰虛陽亢型、腎氣虧虛型。

1.2.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合高血壓病、血脂異常西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)；年齡≥65歲，男性；合并糖尿病、心臟病及心腦血管病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓者；繼發(fā)性血脂異常者；合并嚴(yán)重肝、腎、呼吸及精神病者；合并腫瘤、自身免疫性疾病、妊娠及哺乳期婦女。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 資料與樣本采集 收集病人年齡、身高、體重、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血壓、既往史、用藥史、家族史等資料，由兩名主治醫(yī)師及以上醫(yī)生共同對病人進(jìn)行中醫(yī)辨證分型。留取病人清晨空腹靜脈血，用于提取DNA進(jìn)行ApoE基因二代測序。

1.3.2 DNA提取 根據(jù)QLAGENFlexiGene DNA試劑盒提取全血DNA，測定濃度后于-20 ℃保存。

1.3.3 ApoE基因二代測序 運(yùn)用Illumina MiSeq進(jìn)行二代測序。ApoE引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)。靶區(qū)域PCR擴(kuò)增：Primer Pool Mix 5μL，gDNA 3 μL，ddH2O 7 μL，2XM_Enzyme MIX 15 μL(95 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min 18個(gè)循環(huán)；10 ℃ +∞)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后導(dǎo)入測序接頭：2XM_Enzyme MIX 10 μL，DNA(上階段產(chǎn)物)8 μL，2PCRprimer F 0.25 μL，2Barcodeprimer R 0.5 μL，ddH2O 1.25 Ml(95 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min，18個(gè)循環(huán)；10 ℃ +∞)。產(chǎn)物進(jìn)行兩輪純化回收后，采用llumina MiSeq測序儀進(jìn)行測序。

2 結(jié) 果

2.1 各證型老年男性高血壓病病人基線資料比較 老年男性高血壓病病人中，肝火亢盛組年齡(73.84±5.70)歲；陰虛陽亢組年齡(75.34±5.77)歲；痰瘀互結(jié)組年齡(76.5±6.63)歲；腎氣虧虛組年齡(74.14±6.35)歲。4種證型間病人年齡分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各證型間兩兩組間比較，校正P值后發(fā)現(xiàn)，年齡在肝火亢盛證與痰瘀互結(jié)證之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。4種證型病人病程、吸煙、飲酒、BMI、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 4種證型老年男性高血壓病病人基線資料比較

2.2 ApoE突變位點(diǎn)基因型的檢測結(jié)果 本研究共檢測到3個(gè)突變頻率較高的位點(diǎn)，包括rs769449、rs429358、rs7412，其突變頻率分別為13.38%、14.79%、13.03%。4個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 各基因型在4種中醫(yī)證型間的分布 rs769449、rs429358、rs7412基因型在老年高血壓病病人4種中醫(yī)證型的分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各基因型在4種中醫(yī)證型間的分布 單位：例

2.4 各證型間不同基因型、血脂水平分析

2.4.1 肝火亢盛證 在肝火亢盛證中，rs769449、rs429358基因型間TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs7412基因型間TC的水平相似，而在TG、LDL-C、HDL-C水平方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在老年高血壓病肝火亢盛證中，rs7412 CC型具有較低的TG、LDL-C的水平和較高的HDL-C水平。詳見表3。

2.4.2 陰虛陽亢證 在陰虛陽亢證中，rs769449基因型間TG的水平相似，在TC、LDL-C和HDL-C水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在老年高血壓病陰虛陽亢證中，rs769449 GG型具有較低的TC、LDL-C、HDL-C水平。rs429358基因型間TG、TC和LDL-C的水平相似，在HDL-C水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在老年男性高血壓病陰虛陽亢證中，rs429358 TT型具有低水平HDL-C。rs7412基因型間TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。詳見表3。

2.4.3 痰瘀互結(jié)證 在痰瘀互結(jié)證中，rs769449、rs7412基因型間TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs429358基因型間TG和HDL-C的水平相似，在TC和LDL-C水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在老年男性高血壓病痰瘀互結(jié)證中，rs429358 TT型TC、LDL-C的水平較高。詳見表3。

2.4.4 腎氣虧虛證 在腎氣虧虛證中，rs769449、rs429358、rs7412基因型間TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。詳見表3。

表3 4種證型不同基因型血脂水平比較 (±s) 單位：mmol/L

TT型比較，③P<0.05；與痰瘀互結(jié)型rs429358 TT型比較，④P<0.05。

3 討 論

原發(fā)性高血壓病是由環(huán)境、個(gè)體差異和基因等諸多因素互相作用而導(dǎo)致的，其中有30%～50%的個(gè)體高血壓風(fēng)險(xiǎn)歸因于遺傳因素[10]。血脂異常是高血壓病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一，我國35歲以上人群約有2 500萬人同時(shí)患有高血壓病和高脂血癥，兩者間相互影響、相互促進(jìn)[11]。ApoE是一個(gè)由299個(gè)氨基酸組成的磷脂糖蛋白，分子量為34 kD，其基因位于19號染色體的長臂，有顯著的遺傳多態(tài)性。ApoE多態(tài)性與高血壓及血脂異常之間存在關(guān)聯(lián)[5，12]。

證候是疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，是機(jī)體內(nèi)因和環(huán)境外因綜合作用的反應(yīng)狀態(tài)， 可隨著病程的發(fā)展而發(fā)生相應(yīng)變化[13]，但在一些慢性病病人中，臨床常觀察到中醫(yī)證型和臨床表型的相對穩(wěn)定姓。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度而言，疾病發(fā)生過程是相關(guān)基因與內(nèi)外環(huán)境相互作用的結(jié)果，表現(xiàn)為多基因復(fù)雜性和動態(tài)演變過程，這與中醫(yī)學(xué)以證候概括發(fā)病過程的方法有相似之處，基因作為遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是證候形成的主要原因之一[14-15]。近年來，學(xué)者們開展了大量基因分型與中醫(yī)證候相關(guān)性的研究，但ApoE基因型與高血壓中醫(yī)證型及血脂之間相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。

在中醫(yī)學(xué)古籍文獻(xiàn)中雖無“高血壓病”病名的記載，但根據(jù)其癥狀、演變及并發(fā)癥，可將其歸屬到中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等疾病的范圍。本研究將高血壓病分為4個(gè)證型，即肝火亢盛證、陰虛陽亢證、痰瘀互結(jié)證、腎氣虧虛證。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，上海某社區(qū)老年男性高血壓病病人占比最多的是肝火亢盛證，這種分布情況與現(xiàn)代醫(yī)家對高血壓病的認(rèn)識大體一致。其中痰瘀互結(jié)證年齡高于肝火亢盛證，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)，考慮年老體虛，正氣不足，臟腑衰弱氣機(jī)不暢，更易出現(xiàn)痰瘀。運(yùn)用Illumina Miseq共檢測到22個(gè)ApoE基因突變位點(diǎn)，均符合Hardy-Weinberg平衡，其中rs769449、rs429358、rs7412突變率分別為13.38%、14.79%、13.03%。rs769449、rs429358、rs7412基因型在老年男性高血壓中醫(yī)證型分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在肝火亢盛證中，rs7412基因 CC型具有較低的TG、LDL-C的水平和較高的HDL-C的水平(P<0.05)。在陰虛陽亢證中，rs769449 GG型具有較低的TC、LDL-C、HDL-C水平(P<0.05)。rs429358 TT型具有低水平的HDL-C(P<0.05)。在痰瘀互結(jié)證中， rs429358 TT型TC、LDL-C的水平較高(P<0.05)。

在老年男性高血壓病病人中，rs7412 CC型是肝火亢盛證血脂異常的保護(hù)因素，rs769449 GG型是陰虛陽亢證血脂異常的保護(hù)因素，rs429358 TT型是陰虛陽亢證及痰瘀互結(jié)證血脂異常的危險(xiǎn)因素。由于高血壓病是一種由多因素綜合影響導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，其證型受年齡、地域、氣候、環(huán)境等因素影響，并且高血壓病易感性基因較多，機(jī)制尚未完全闡明清楚。本課題對ApoE基因型與中醫(yī)證型及血脂的相關(guān)性研究，受研究地域及年齡層次、樣本數(shù)等限制，仍需進(jìn)一步深入探索。