戴志亮 劉賢旭 張 君

（廣東科貿(mào)職業(yè)學院，廣東廣州 510430）

大部分生物產(chǎn)品是從細胞培養(yǎng)生成，所以一定程度來說細胞培養(yǎng)技術是生物技術中最基礎和較為核心的技術[1]。本文對細胞培養(yǎng)的基本條件、凍存與細胞復蘇和細胞培養(yǎng)簡單進行一個探討。

1 細胞培養(yǎng)的基本條件

1.1 無菌設計與無菌操作

1.1.1 實驗室設計及設備

細胞培養(yǎng)室的設計原則是防止微生物污染和有害因素干擾，要求空氣清新、干燥、無塵煙。一般無菌操作區(qū)設在走動較少的內(nèi)側，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，洗刷消毒在另外一室。需要設置區(qū)域有：更衣間、緩沖間、操作間。其中操作間放置超凈工作臺、倒置顯微鏡、離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱、電冰箱、放置無菌物品的架子等[2]。

1.1.2 無菌操作

主要分為三個部分：工作環(huán)境維護，細胞培養(yǎng)用的玻璃制品的處理，培養(yǎng)液及培養(yǎng)細胞的處理。

工作環(huán)境維護包括：實驗前超凈工作臺打開紫外燈照射30min滅菌；進入超凈工作臺的物品要用75% 酒精噴灑，擦拭，即可，每次只能處理一種細胞，以免造成交叉感染；實驗結束后要將細胞器皿清理出臺面，然后用酒精擦拭臺面。必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通；操作時切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實驗；工作人員必須穿戴實驗服與手套后才進行實驗；定期檢查C02鋼瓶內(nèi)的C02壓力；C02培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染；無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜，預濾網(wǎng)；玻璃制品的處理：在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學物質，均影響培養(yǎng)細胞的生長。因此對新使用玻璃器皿和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴格徹底的清洗并做好消毒工作。

培養(yǎng)液及培養(yǎng)細胞的處理：細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水；胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。在pH為8.0、溫度為37 °C時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。

1.2 溫度及氣體條件

1.2.1 溫度的影響

維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度，不同種類的細胞對培養(yǎng)溫度要求也不同。哺乳動物細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5°C±0.5°C，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；哺乳動物細胞在39～40℃ 1h，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40～41℃1h，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復；41～42℃ 1h，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1h，細胞全部死亡[3-5]。

相反，溫度不低于0℃時，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作用；把細胞放入25～35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4℃數(shù)小時后，再回到37℃培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長，細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如-80℃或-196℃（液氮）長期保存。

1.2.2 氣體條件需求

氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必須條件之一，所需氣體主要有95% O2+ 5% CO2。適當?shù)腃O2是有利于細胞生長的，如果完全沒有CO2，細胞也會像人一樣出現(xiàn)醉氧的；CO2對細胞培養(yǎng)液中的PH值有著重要意義，CO2可以融入到培養(yǎng)液中，也可以從中釋放，這取決于細胞的生長狀態(tài)和環(huán)境變化，碳酸根離子也是常見的緩沖離子，對維持細胞穩(wěn)定的生長環(huán)境至關重要。

2 細胞凍存與細胞復蘇

2.1 細胞凍存

所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。

水在低于零度的條件下會結冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-196℃）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196℃時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-196℃下均可保存十年以上。目前應用較廣的冷凍保護劑是DMSO，但在常溫時對細胞毒害作用較大，因此在細胞復蘇后及時洗滌冷凍保護劑。

操作方法如下：

2.1.1 待冷凍細胞懸液的制備

（1）按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)；（2）將細胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜；（3）向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml；（4）按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；（5）再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。

2.1.2 分級冷凍

（1）先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8°C），約40min；（2）接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-10～-20℃），約30～60min；（3）將凍存管轉入低溫冰箱（-30℃），放置30min左右；（4）然后將凍存管轉移到超低溫冰箱（-70～-80℃），過夜；（5）最后將凍存管投入液氮保存。

2.1.3 記錄

做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。

2.2 細胞復蘇

（1）調配37～40℃的溫水，或將恒溫水浴箱的溫度調節(jié)至37～40℃；（2）從液氮中取出凍存管，立即投入37～40℃溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解；（3）將細胞凍存懸液轉移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；（4）將細胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜；（5）向細胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

3 細胞培養(yǎng)方法

3.1 一般體細胞培養(yǎng)方法

其傳代程序為：（1）吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中；（2）用溫PBS沖洗2～3次；（3）用0.25%溫胰蛋白酶置37℃消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可：作用1～5min；（4）待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；（5）加入培養(yǎng)液后，用玻璃吸管輕輕反復吹打制成單個細胞懸液，應避免吹出氣泡；（6）按所需比例比例接種到新培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)。

3.2 懸浮培養(yǎng)法

某些細胞要求懸浮培養(yǎng)，否則不能存活。舉例High five 細胞：

（1）細胞計數(shù)，培養(yǎng)密度控制在0.8～1.0 106cells/ml以下，置于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉速100～130rpm，每48h進行傳代（正常速率為48h增長為5～7倍）。

（2）當密度大于0.8～1.0×106cells/ml，觀察細胞狀態(tài)是否健康良好，則可以一分為二，加入新鮮培養(yǎng)基至200ml刻度。

3 結論

細胞培養(yǎng)經(jīng)過了長時間的摸索和實踐，已經(jīng)得到了進一步的完善和發(fā)展，隨著生物科技的快速發(fā)展，如細胞雜交、DNA介導的基因轉移以及一些物理圖譜的建立，也都與細胞培養(yǎng)緊密聯(lián)系在一起，還已經(jīng)涉及到生物學、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護等諸多領域[6]。細胞培養(yǎng)技術是基礎中基礎，是細胞培養(yǎng)及其延伸的各行各業(yè)各領域中不可或缺的一環(huán)節(jié)，想要更好的實驗結果實驗產(chǎn)品更加離不開基礎的細胞培養(yǎng)技術操作原理。