宋武慧，潘濱，闞海東，徐燕意，易志剛

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，上海 200032

2019年12月在我國(guó)武漢出現(xiàn)的不明原因肺炎由新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)感染所致[1-4]。隨后，2019-nCoV蔓延至全國(guó)，截至2020年2月9日，已導(dǎo)致 37 289 人感染，死亡人數(shù)達(dá)813人。2019-nCoV主要經(jīng)呼吸道和接觸傳播，以聚集性傳播尤為嚴(yán)重。呼吸道防護(hù)是防控該疾病的關(guān)鍵之一，可減少二次傳播的概率。由于疫情持續(xù)蔓延，口罩等個(gè)人防護(hù)用品短缺現(xiàn)象嚴(yán)重。目前，流傳許多口罩再生方法，但大多缺乏科研數(shù)據(jù)，未曾證明滅活病毒的效果，以及滅活病毒處理后對(duì)口罩濾過功能的影響。

流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)病毒與2019-nCoV均為有包膜病毒，理化性質(zhì)相似，且均主要經(jīng)呼吸道傳播。本研究以普通一次性醫(yī)用口罩為例，用流感病毒作為模型病毒，模擬2019-nCoV污染，采用常用的恒溫烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理2種方法，對(duì)表面污染有流感病毒的一次性醫(yī)用口罩進(jìn)行處理，檢測(cè)熱處理對(duì)病毒的滅活效果及口罩濾過截留PM2.5效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

一次性醫(yī)用外科口罩(ASTM F2100，等同于YY0469-2011)[5]。某品牌家用電吹風(fēng)機(jī)(50 Hz, 1 400 W)。流感病毒H1N1 A/PR8/34 毒株從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC? VR-95TM)引進(jìn)；Mardin-Darby狗腎細(xì)胞(Mardin-Darby canine kidney cell，MDCK細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，培養(yǎng)基為含5% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibco公司)。TPCK-胰酶購(gòu)自Sigma公司，病毒采樣管購(gòu)自友康生物科技有限公司。QIAamp Viral RNA抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司(貨號(hào)：52904)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescence quantitative polymerasechain reaction, 實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR)采用One Step PrimeScript RT-PCR 試劑盒(TAKARA公司，RR064A)。

1.2 病毒滅活

恒溫烘箱干熱處理：流感病毒濃縮液3.6×107pfu/ml，分別取10 μL滴加于口罩防水層(藍(lán)色)表面3個(gè)不同位置(病毒操作在生物安全柜中進(jìn)行)，滴加病毒的口罩置于錫箔紙上，然后放入鋁質(zhì)飯盒，加蓋后放入恒溫烘箱56 ℃、30 min干熱處理。

電吹風(fēng)熱風(fēng)處理：將滴加有病毒的口罩用保鮮袋包裹，然后在生物安全柜中用電吹風(fēng)機(jī)(最大檔)在口罩上方10～20 cm處進(jìn)行熱風(fēng)處理。

1.3 病毒洗脫及感染

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將0.25 mL MDCK細(xì)胞(4×105細(xì)胞/mL)鋪板于48孔板中培養(yǎng)。

1.3.2 病毒感染經(jīng)上述熱處理后的口罩，可見病毒滴液斑痕，利用250 μL病毒采樣管中的病毒保存液沖吸數(shù)次，洗脫病毒至病毒滴液斑痕消失。取125 μL洗脫的病毒懸液并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，接種于細(xì)胞中，37 ℃下病毒吸附1 h；然后吸取病毒懸液，用1 mL DMEM培養(yǎng)液洗滌2遍，加入新鮮的1 μg/mL TPCK-胰酶的DMEM培養(yǎng)液。感染2 d后，觀察細(xì)胞病變，并收集細(xì)胞上清液。

1.4 實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR檢測(cè)病毒RNA

收集140 μL感染細(xì)胞的上清液，用QIAamp Viral RNA抽提試劑盒抽提RNA(根據(jù)試劑盒說明書操作)。50 μL無RNase的H2O洗脫。取2 μL RNA標(biāo)本，使用One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒，利用引物Yi-js-O-97、Yi-js-O-98及FAM標(biāo)記的TaqMan熒光探針Yi-js-P-1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR。PCR體系如下：12.5 μL的 2×one step RT-PCR緩沖液、0.5 μL的Ex Taq HS、0.5 μL的RT Enzyme、7.0 μL的H2O、0.8 μL的Yi-js-O-97 (10 μmol/L, 終濃度400 nmol/L)、0.8 μL的Yi-js-O-98 (10 μmol/L,終濃度400 nmol/L)、0.4 μL的Yi-js-P-1熒光探針 (10 μmol/L，終濃度200 nmol/L)及2.0 μL RNA樣品。反應(yīng)程序如下：42 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min(同時(shí)收集熒光信號(hào))，共 40個(gè)循環(huán)。樣本中病毒RNA的相對(duì)拷貝數(shù)以2-ΔCt方法進(jìn)行處理，比值由2-(處理組Ct-未處理組Ct)公式計(jì)算得出。各處理方法相對(duì)于未處理感染病毒組為對(duì)照。

1.5 口罩濾過截留效率的評(píng)價(jià)

采用抽濾瓶(蜀牛，GG-17)和PM2.5監(jiān)測(cè)儀(TSI，AM510)，評(píng)估一次性普通醫(yī)用口罩的烘干處理對(duì)其PM2.5濾過截留效果的影響。將口罩分為4組：①潔凈組(未使用過的口罩)；②未處理組(口罩正常使用4 h后未作任何處理)；③烘箱處理組(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理)；④吹風(fēng)機(jī)處理組。將口罩(N=3個(gè)/組)嚴(yán)密束縛在抽濾瓶瓶口，使用AM510粉塵儀同時(shí)檢測(cè)口罩正上方和抽濾瓶上嘴出口處的PM2.5濃度，抽濾時(shí)間為4 h。每隔30 min記錄PM2.5濃度數(shù)據(jù)，每次重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié)果

2.1 口罩表面的病毒滅活

將一次性醫(yī)用外科口罩置于錫箔紙上，在口罩藍(lán)色的防水層表面3個(gè)不同位置滴加流行性感冒病毒A/PR8懸液(圖1A)，每個(gè)位點(diǎn)滴加10 μL(含3.6×105pfu 病毒 )?？谡直砻娴牟《緦⒉捎孟率?種方法處理(每種方法3個(gè)口罩)。①用普通烘箱干烤：將滴加病毒的口罩(下墊錫箔紙)，放入鋁盒，加蓋后放入普通烘箱，56 ℃ 30 min干熱處理(56 ℃、30 min通常為滅活血清等標(biāo)本中病毒的條件)，見圖1A。干熱處理后，口罩表面可見病毒懸液斑痕，由于口罩表面的疏水性，待病毒洗脫后，病毒懸液斑痕溶于洗脫液，〔斑痕消失(圖1A)，口罩表面的疏水性無明顯改變(圖1A，向下箭頭所指)〕。②用家常用電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理：將滴加有病毒的口罩用保鮮袋包裹，在口罩上方10～20 cm處電吹風(fēng)機(jī)加熱吹風(fēng)(最大檔)，電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理1 min 30 s 后，風(fēng)口溫度可升至70 ℃，并持續(xù)維持在該溫度)，熱風(fēng)處理共30 min?？谡窒扔帽ｕr袋包裹是因?yàn)榭谡直砻媸杷詮?qiáng)，不便于熱風(fēng)處理。為防止吹風(fēng)將沾染的病原體散布，可將10 μL病毒懸液(含3.6×105pfu病毒 )滴加于口罩的褶皺層中，用保鮮袋包裹，然后加熱吹風(fēng)(圖1B)。30min熱風(fēng)處理后，洗脫滴加于口罩的病毒，發(fā)現(xiàn)電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理不影響口罩表面的疏水性(圖1B，向右箭頭所指)。

A. The left, virus drops was doted onto the surface of medical mask before baking; The Right, after baking, the traces of virus drops was visible and disappeared after virus rescue. B. The left, virus drops was doted onto between the kink marks of mask; The Right, the mask was wrapped with a food storage bag and then heat treated with hair dryer by moving around over the surface of the wrapped mask vertically at a distance of about 10～20 cm. The virus was rescued as described above.

圖1 口罩的病毒滅活實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Fig.1 Design of the heat inactivation of medical mask

2.2 電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理滅活病毒的效果優(yōu)于烘箱干烤

將滴加于口罩上并經(jīng)滅活方法處理的流感病毒A/PR8洗脫后感染MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變及測(cè)定細(xì)胞上清液中的病毒基因組拷貝數(shù)，分別評(píng)價(jià)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理滅活病毒的效果。未經(jīng)滅活處理組的病毒洗脫液接種至MDCK細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變；但經(jīng)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理，洗脫液接種的細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖2A)。

收集感染細(xì)胞上清液，提取RNA，利用實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)。電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理組的感染細(xì)胞上清液中病毒拷貝數(shù)降低至原來的1/1 000 000～1/10 000 000，接近未感染組水平。然而，烘箱干熱處理組感染細(xì)胞上清液中的病毒拷貝數(shù)降低至原來的1/10～1/100，但仍高于未感染組 (圖2B)，提示病毒未被充分滅活。

A.CPE of infected MDCK cells. B. Relative RNA copies of IVA RNA.

圖2 病毒滅活效果評(píng)價(jià)

Fig.2 Infectivity of the rescued virus after hair dryer treatment

2.3 熱處理后口罩濾過截留效率不變

為探討經(jīng)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理對(duì)口罩的濾過截留效率的影響，進(jìn)一步檢測(cè)了處理后的口罩濾過截留PM2.5的效果(圖3A)。將口罩分為4組：①潔凈組(未使用的口罩)； ②未處理組(口罩正常使用4h后未作任何處理)；③烘箱干熱處理組(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理)；④吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理組。將口罩(N=3個(gè)/組)嚴(yán)密束縛在抽濾瓶瓶口，使用AM510粉塵儀同時(shí)檢測(cè)口罩正上方和抽濾瓶上嘴出口處的PM2.5濃度，抽濾時(shí)間為4 h，每隔30 min記錄PM2.5濃度數(shù)據(jù)。

從圖3B中可見，4組口罩的PM2.5濾過截留效果隨抽濾時(shí)間的改變而有所變化，但其改變均不顯著。其中，潔凈口罩的PM2.5濾過截留效率隨抽濾時(shí)間的增長(zhǎng)而略微降低；電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理已使用的口罩PM2.5濾過截留效率隨抽濾時(shí)間的增長(zhǎng)略有提升，但不顯著；另外2組(未處理組和烘箱干烤處理組)PM2.5濾過效率在4 h的抽濾過程中略有波動(dòng), 但基本保持穩(wěn)定。如圖3C所示，4 h內(nèi)口罩的平均PM2.5濾過效率表明，使用前、后的口罩濾過截留PM2.5的效率基本無變化，而烘箱干熱或電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理后的口罩PM2.5濾過截留效率也基本無改變，整體維持在85%左右。結(jié)果提示，烘箱或電吹風(fēng)機(jī)熱處理基本不會(huì)影響普通一次性醫(yī)用口罩濾過截留大氣細(xì)顆粒物的效率。

A. Experiment set up. B. PM2.5 filtration rate change during the 4-hour suction process. C. Average PM2.5 filtration rate within the suction process.

圖3 口罩濾過截留效果評(píng)價(jià)

Fig.3 PM2.5 filterability of medical masks after heart treatment

3 討論

個(gè)人防護(hù)用品在滅活其表面潛在的病毒后再生利用可以節(jié)省資源，減少二次傳播。2006年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)行政院勞工安全衛(wèi)生研究所曾對(duì)N95等幾種口罩的重復(fù)利用做過報(bào)道，認(rèn)為70 ℃ 30 min干熱及250 nm 紫外線照射可殺滅大腸埃希菌而不損壞口罩本身，其可被重復(fù)利用(https://labor-elearning.mol.gov.tw/co_report_detail.php?rid=115)。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑，如酒精、濕熱等均會(huì)損傷濾膜，不宜使用。最近，北京大學(xué)報(bào)道了用微波爐處理再生口罩的實(shí)驗(yàn)(https://www.sohu.com/a/370944754_803988)，但考慮到有些口罩含有金屬條，處理前需先去除口罩的金屬絲，處理后再將金屬絲復(fù)位。此外，各種報(bào)道的口罩再生方法是否影響濾過截留功能以及對(duì)病毒的滅活效果有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

再生一次性醫(yī)用口罩的方法還需考慮以下方面的因素：既不能影響過濾效率，還必須去除其可能沾染的病原體，且盡可能方便操作。醫(yī)用外科口罩由3部分組成，從外到內(nèi)分別由藍(lán)色的防水層、中間的過濾層及白色的無紡布舒適層。為評(píng)價(jià)口罩經(jīng)熱處理對(duì)其過濾效率的影響，首先，我們測(cè)試了處理前、后口罩對(duì)PM2.5的濾過截留效果。由于醫(yī)用外科口罩并不能阻擋納米級(jí)的病毒，采用了PM2.5的濾過截留效果作為參考。結(jié)果未觀察到熱處理對(duì)口罩PM2.5濾過截留效果產(chǎn)生影響。由于用過的醫(yī)用外科口罩上可能沾有病原體，為了模擬2019-nCoV，我們依據(jù)流感病毒與其都有包膜等相似理化性質(zhì)，以污染有流感病毒的醫(yī)用外科口罩作為模型，用常用的熱滅活方式(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理和比較有普及性及簡(jiǎn)便的家用電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理)，評(píng)價(jià)2種熱處理對(duì)病毒的滅活效果。結(jié)果顯示, 電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理后病毒拷貝數(shù)降低至原來的 1/1 000 000～1/10 000 000，接近未感染水平。由于本研究中使用了高劑量的病毒懸液，電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理后仍然檢測(cè)到病毒RNA，可能為感染后未完全洗滌干凈的病毒殘留(我們認(rèn)為病毒已全部滅活)。但烘箱56 ℃ 30 min干熱處理僅降低病毒拷貝數(shù)至原來的1/10～1/100，顯示未能完全滅活病毒 (圖2B)。處于生物安全考慮，我們進(jìn)行烘箱干熱處理時(shí)，口罩置于封閉鋁質(zhì)飯盒內(nèi)，可能會(huì)影響飯盒內(nèi)口罩表面的實(shí)際溫度。適當(dāng)延長(zhǎng)干烤時(shí)間可能有更好的效果，或口罩如直接放置于烘箱內(nèi)可能效果更佳。因此提示，用干熱滅活病原體時(shí)需要考慮熱滅活的穿透性能。

為解決當(dāng)前普通醫(yī)用口罩短缺的問題，課題組通過濾過截留及病毒滅活實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)了用熱處理進(jìn)行普通醫(yī)用口罩的再生利用，將用過的口罩用保鮮袋包裹( 防止吹風(fēng)將沾染的病原體散布)，用家用簡(jiǎn)便電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理即可安全、有效地再生醫(yī)用外科口罩。目前我們尚未測(cè)試一次性醫(yī)用外科口罩最多可再生幾次，有關(guān)研究正在進(jìn)行中。

然而，值得指出的是：在口罩匱乏的非常時(shí)期，普通人群可采用該簡(jiǎn)便技術(shù)再生口罩后再次使用，但該方法再生的口罩不適合密切接觸患者的人群、醫(yī)護(hù)人員及實(shí)驗(yàn)室工作人員使用。

致謝

感謝實(shí)驗(yàn)參與人員在短期內(nèi)完成上述工作，感謝聞?dòng)衩吩菏拷o予的指導(dǎo)！