裴方寧，楊帆，湯杰，于麗芳

（華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海分子治療與新藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，上海 200062）

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）屬于膜蛋白家族，它由穿過質(zhì)膜的7個(gè)α-螺旋構(gòu)成，膜內(nèi)為C端，膜外為N端。目前，靶向GPCR藥物的銷售額約占全球藥物市場(chǎng)份額的27%[1]。大麻素受體屬于GPCR的A家族，主要包括大麻素Ⅰ型受體（CB1）和大麻素Ⅱ型受體（CB2）2個(gè)亞型[2]，此外，還有GPR18、GPR19和GPR55等[3-4]。GPCR配體包括內(nèi)源性配體 anandamide（AEA）、N-花生四烯酸-多巴胺（NADA）和2-花生四烯酰甘油（2-AG）等[5-6]，另外有植源性配體19-四氫大麻酚（THC）以及合成大麻素配體。目前，大麻素受體及配體存在偏向性逐漸被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識(shí)，其重要性也逐漸體現(xiàn)。

1 大麻素受體主要亞型

CB1由472個(gè)氨基酸組成[7]，主要存在于海馬體、皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)和小腦中，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的一種GPCR[8]。CB1激動(dòng)劑具有治療疼痛、炎癥以及神經(jīng)退行性疾病等疾病的潛在價(jià)值，CB1拮抗劑可用于治療肥胖以及肝纖維化等[9-11]。利莫那班（rimonabant）是首個(gè)應(yīng)用于臨床的CB1拮抗劑，2006年作為新型減肥藥在歐盟上市，但因其存在致抑郁、焦慮甚至自殺等精神方面的嚴(yán)重不良反應(yīng)，2008年被撤市。因此，目前研究多限于外周限制性CB1拮抗劑[12]。

CB2由360個(gè)氨基酸構(gòu)成[7]，與CB1的氨基酸序列存在44%同源性，跨膜區(qū)高達(dá)68%[3-4]。CB2主要存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)的免疫器官、組織及細(xì)胞中，在神經(jīng)元中表達(dá)水平較低[2]。CB2受體與多發(fā)性硬化[13]、阿爾茨海默病[14]和肝纖維化[15]等疾病的炎癥過程有關(guān)。此外，CB2受體還參與緩解疼痛、防止骨質(zhì)流失等生理學(xué)過程[16]。

在CB1拮抗劑-受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，拮抗劑以類似T形的形態(tài)結(jié)合到口袋中，CB1受體的N末端在配體識(shí)別中起關(guān)鍵作用：N末端的非截短部分形成V形環(huán)，插入配體結(jié)合口袋中，充當(dāng)塞子以限制小分子化合物從細(xì)胞外側(cè)進(jìn)入口袋。同時(shí)，第2個(gè)細(xì)胞外環(huán)折疊成復(fù)雜結(jié)構(gòu)，使氨基酸殘基268 ～ 271突出到結(jié)合口袋中[2]，這4種氨基酸殘基對(duì)配體與受體的相互作用至關(guān)重要[17]。此外，半胱氨酸Cys257、Cys264與CB1的功能關(guān)系密切，這可能與二硫鍵穩(wěn)定了受體的構(gòu)象使得配體可識(shí)別有關(guān)（見圖1）[18]。

CB1激動(dòng)劑以L形結(jié)合到口袋中，相較于拮抗劑，其結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著重排：螺旋Ⅰ向內(nèi)彎曲6.6 ?，螺旋Ⅱ旋轉(zhuǎn)約6.8 ?，螺旋Ⅵ向外移動(dòng)約8?，導(dǎo)致結(jié)合口袋體積減少53%。該結(jié)構(gòu)重排與Phe2003.36和Trp3566.48協(xié)同構(gòu)象改變關(guān)系密切，被稱為“雙撥動(dòng)開關(guān)”。在CB1拮抗劑的結(jié)合口袋中，Phe2003.36指向遠(yuǎn)離配體結(jié)合口袋方向，并與Trp3566.48形成π-π堆積相互作用；而在CB1激動(dòng)劑的結(jié)合口袋中，螺旋Ⅲ的協(xié)同旋轉(zhuǎn)和Phe2003.36的側(cè)鏈翻轉(zhuǎn)可使苯環(huán)指向配體，同時(shí)，螺旋Ⅵ的向外旋轉(zhuǎn)致Trp3566.48的側(cè)鏈偏離配體，破壞了Phe2003.36和Trp3566.48的π-π堆積相互作用，因此該“雙撥動(dòng)開關(guān)”可能與CB1受體激活相關(guān)（見圖2）[19]。

CB2拮抗劑的結(jié)合情況整體上與CB1拮抗劑不同，與其中關(guān)鍵殘基Trp6.48構(gòu)象也不同。CB2拮抗劑將Trp2586.48的側(cè)鏈限制在一種相對(duì)稀有的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體中，受限的Trp2586.48構(gòu)象可能會(huì)限制螺旋Ⅵ的向外移動(dòng)；CB1拮抗劑將螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ向外推，使Phe2003.36限制Trp3566.48的移動(dòng)。與CB1激動(dòng)劑相似，CB2拮抗劑也以L形結(jié)合到口袋中，兩者細(xì)胞外部分相似，并且關(guān)鍵氨基酸殘基幾乎相同，均包括：Phe183ECL2、Phe872.57、Val1133.32、Phe1173.36、Trp2586.48、Thr1143.33、Ile186ECL2、Trp1945.43、Ser1654.57、Phe912.61、Phe942.64和His952.65（見圖 3）[20]。

2 大麻素受體信號(hào)通路

GPCR負(fù)責(zé)將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)，它被特定配體激活后，與異源三聚體G蛋白結(jié)合并水解三磷酸鳥苷，從而介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)。G蛋白由Gα、Gβ和Gγ 3個(gè)亞基組成。Gα亞基可進(jìn)一步被分為 4 個(gè)亞組：Gαs、Gαi/o、Gαq/11和 Gα12/13[21]。Gα亞基可單獨(dú)傳導(dǎo)信號(hào)，而Gβ和Gγ亞基必須結(jié)合形成Gβγ才可以傳導(dǎo)信號(hào)。GPCR偶聯(lián)G蛋白后，受體活化調(diào)節(jié)關(guān)鍵效應(yīng)物肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）、腺苷酸環(huán)化酶（AC）等介導(dǎo)第二信使Ca2+、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）等的產(chǎn)生。Gβγ亞基可以作為離子通道調(diào)節(jié)劑或受體激酶等調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。

GPCR不僅受G蛋白調(diào)控，還受支架蛋白的調(diào)控，受支架蛋白調(diào)控的信號(hào)通路被稱為非G蛋白依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其中研究較為充分的是β-arrestin依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑[22]。GPCR活化后可釋放、激活相關(guān)G蛋白，G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRK）磷酸化GPCR細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，磷酸化的GPCR募集β-arrestin，使得GPCR內(nèi)化和信號(hào)傳導(dǎo)脫敏，導(dǎo)致傳導(dǎo)信號(hào)的“關(guān)閉”，從而產(chǎn)生G蛋白依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)反饋[23]。

大麻素受體主要通過抑制Gαi/o傳導(dǎo)信號(hào)來抑制AC活性，從而導(dǎo)致cAMP水平降低（見圖4）[24]，還可以與β-arrestin作用來調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）的產(chǎn)生[25]。在某些情況下，CB1能夠與Gαs偶聯(lián)，從而刺激cAMP產(chǎn)生，與Gαq共同調(diào)節(jié)Ca2+的產(chǎn)生[26]，目前尚不清楚CB2是否可以與其他G蛋白結(jié)合，大麻素受體信號(hào)通路與靶標(biāo)作用的關(guān)系也不明確。有研究表明，大麻素受體配體若偏向于Gαi/o信號(hào)傳導(dǎo)通路，有利于細(xì)胞存活，保持亨廷頓蛋白突變細(xì)胞的功能，這一原理可用來治療亨廷頓?。℉D）[16]；若激活Gαi/o信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低β-arrestin作用，可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用同時(shí)降低藥物成癮性[27]。

3 偏向性信號(hào)傳導(dǎo)

長期以來人們一直認(rèn)為GPCR與G蛋白或β-arrestin偶聯(lián)后可并行或有序地觸發(fā)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[28]。直到1995年，Kenakin[29]首次提出了GPCR偏向信號(hào)傳導(dǎo)的概念。同一配體對(duì)各種細(xì)胞反應(yīng)可顯示出不同的功效，稱為功能選擇性或偏向性[30]?！肮δ苓x擇性”是較早的術(shù)語，僅表示一種或多種功能的功效差異，而“偏向性”是對(duì)不同通路（例如G蛋白與β-arrestin）定量的分析[31]。偏向性信號(hào)不僅存在于G蛋白和β-arrestin之間，也存在于G蛋白不同亞型之間。目前，偏向性信號(hào)傳導(dǎo)的具體分子機(jī)制尚不清楚，被業(yè)內(nèi)普遍接受的是受體磷酸化的“條形碼（BarCode）”假說。該假說認(rèn)為，偏向性配體能夠誘導(dǎo)一種獨(dú)特的受體構(gòu)象，然后通過效應(yīng)子（如G蛋白或β-arrestin）來激活特定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[32-33]。例如，在第二信使蛋白Gαs存在下，β2腎上腺素受體與其激動(dòng)劑的構(gòu)象已被證實(shí)較為獨(dú)特，TM6的胞內(nèi)末端向外移動(dòng)了2.1 ?，保守脯氨酸殘基向外移動(dòng)了1.4 ?[34]。受體構(gòu)象的差別導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GRK對(duì)受體磷酸化行為的改變，進(jìn)而調(diào)控β-arrestin的招募。GRK2/3和GRK5/6通過對(duì)不同C末端區(qū)域磷酸化來發(fā)揮條形碼作用。GRK5/6磷酸化受體被認(rèn)為是β-arrestin信號(hào)通路偏向性的標(biāo)簽；而GRK2/3磷酸化受體被認(rèn)為是G蛋白信號(hào)通路偏向性的標(biāo)簽[35-36]。典型GPCR如血管緊張素I型受體（At1R）的偏向性信號(hào)研究發(fā)現(xiàn)，無配體結(jié)合的At1R本身就存在構(gòu)象集合，大多數(shù)氨基酸殘基對(duì)之間存在2種不同的距離，而不是單一的非激活態(tài)；與無配體結(jié)合相比，At1R與反向激動(dòng)劑結(jié)合后，ICL2-TM6和TM5-Helix8之間的距離變化較大；At1R與激動(dòng)劑結(jié)合后的變化更明顯，TM1-TM6之間的距離從31 ～ 34 ?變?yōu)?2 ?左右，ICL2-TM7之間的距離變短，與此同時(shí)TM7發(fā)生內(nèi)傾；受體不僅在拮抗和激動(dòng)時(shí)構(gòu)象不同，激動(dòng)不同信號(hào)通路時(shí)構(gòu)象也存在差異，β-arrestin偏向性激動(dòng)的受體構(gòu)象中TM7內(nèi)移，ICL2大幅內(nèi)移，TM5小幅外移，TM6大幅外移，該構(gòu)象特點(diǎn)會(huì)阻礙其與G蛋白偏向性配體的結(jié)合；G蛋白偏向性激動(dòng)的構(gòu)象特點(diǎn)為TM7內(nèi)移，TM6外移，TM5大幅向TM6移動(dòng)，ICL2基本不移動(dòng)，這使得其有利于和G蛋白偏向性配體相結(jié)合[37]。該研究為偏向性信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其他GPCR作用機(jī)制研究提供了新的思路。

目前，對(duì)GPCR偏向性配體的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，其中，μ-阿片受體的偏向性配體oliceridine正處于臨床研究階段。Oliceridine可以選擇性地激活G蛋白通路，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，而不與β-arrestin通路作用[38-39]，從而減輕甚至避免阿片類藥物產(chǎn)生的便秘、呼吸抑制和成癮性等不良反應(yīng)[37]。在抗精神病藥物中也發(fā)現(xiàn)了偏向性配體降低不良反應(yīng)的情況，如aripiprazole、UNC9975和UNC9994可選擇性激動(dòng)β-arrestin信號(hào)通路，改善NR1基因敲除的低谷氨酸能小鼠的精神分裂癥的相關(guān)癥狀，同時(shí)減少了與Gαi偶聯(lián)相關(guān)的多巴胺依賴性過度運(yùn)動(dòng)等不良反應(yīng)[40]。由于偏向性配體可能具有巨大的治療優(yōu)勢(shì)，所以具有偏向性激活大麻素受體的藥物值得大力開發(fā)。目前，對(duì)于大麻素受體偏向性的研究還處于基礎(chǔ)階段，首個(gè)大麻素受體偏向信號(hào)傳導(dǎo)的證據(jù)來自Glass等[41]研究，該研究證實(shí)了CB1激動(dòng)劑AEA和WIN-55212-2對(duì)Gαi激活作用比對(duì)Gαo強(qiáng)。短期使用CB1激動(dòng)劑會(huì)產(chǎn)生不良的精神作用，長期服用會(huì)產(chǎn)生依賴性，吲哚奎尼丁酮類似物PNR-4-20和PNR-4-02是高度偏向G蛋白信號(hào)通路的激動(dòng)劑，與無偏向性CB1激動(dòng)劑相比，其降低了藥物依賴性，減少了不良反應(yīng)[42]。

量化偏向性需要同時(shí)考慮效力和最大響應(yīng)，目前最常用的一種是用轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)來衡量，即通過量化藥物反應(yīng)的Black-Leff模型計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)τ/KA（其中τ：包含激動(dòng)劑效力、受體密度和系統(tǒng)內(nèi)的偶聯(lián)；KA：解離常數(shù)，在功能測(cè)試中為親和力的倒數(shù)）[43]。另外，還可以用相對(duì)活性（log RA）衡量偏向性，log RA = log（max/EC50）（其中max為最大響應(yīng)值；EC50為激動(dòng)劑效力）[44]。另外，還有比較完全激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑活性相同時(shí)的藥物濃度（τ/KA）來衡量量化偏向性，此方法與相對(duì)活性一樣，僅適用于濃度-響應(yīng)曲線斜率無顯著差異的系統(tǒng)[45]。

4 偏向性大麻素受體配體

4.1 CB1配體偏向性

既往研究已經(jīng)證實(shí)了幾種大麻素受體配體對(duì)CB1的作用存在偏向性，其不能均等地激活相關(guān)G蛋白和β-arrestin通路，因此顯示出下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的偏向性。目前，對(duì)于CB1相關(guān)疾病的研究很多，但關(guān)于配體偏向性與其功能之間的具體聯(lián)系研究較少。筆者就此總結(jié)了代表性CB1偏向性配體（內(nèi)源性、植源性、大麻類似物、氨基吲哚類和二苯基類大麻素配體）及其功能（見表1）。

表 1 代表性CB1偏向性配體Table 1 Representative CB1 biased ligands

4.1.1 G蛋白和β-arrestin通路間偏向性 以WIN-55212（化合物1）作為對(duì)照化合物，內(nèi)源性大麻素配體2-AG（化合物2）和AEA（化合物3）相對(duì)于β-arrestin1通路均優(yōu)先選擇Gαi/o通路并且改善HD細(xì)胞的活力；與其相反的是，植源性大麻素配體THC（化合物4）和大麻素類似物CP55940（化合物5）偏向于β-arrestin1通路并且降低HD細(xì)胞的活力。配體偏向性和細(xì)胞活力之間的關(guān)系研究表明，增強(qiáng)Gαi/o信號(hào)傳導(dǎo)可能對(duì)HD治療有益；而偏向β-arrestin1的大麻素配體可能對(duì)HD治療不利[60]。其他合成類大麻素配體的偏向性也各有不同，例如HU-210（化合物6）優(yōu)先激活Gαi/o信號(hào)，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造所得的PNR-4-02（化合物7）和PNR-4-20（化合物8）偏向于Gα信號(hào)通路并且對(duì)β-arrestin信號(hào)通路作用減弱；ORG27569（化合物9）偏向性激活β-arrestin2信號(hào)通路[41]，結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到的PSNCBAM1（化合物10）則優(yōu)先與β-arrestin1發(fā)生作用[59]。

4.1.2 G蛋白不同亞型之間偏向性 偏向性不僅存在于G蛋白與β-arrestin之間，在G蛋白之間也存在偏向性。如2-AG（化合物2）對(duì)Gαi作用強(qiáng)度大于Gαq/11；AEA（化合物3）則對(duì)Gαi作用強(qiáng)度大于Gαs；THC（化合物4）對(duì)Gαi和Gαs作用強(qiáng)度相當(dāng)；CP55940（化合物5）對(duì)不同亞型的G蛋白選擇性存在差異，呈以下順序 Gαs> Gαi> Gαq/11；HU-210（化合物 6）偏向于Gαi/o，與Gαq偶聯(lián)較弱；NADA（化合物11）幾乎只作用于Gαq信號(hào)通路以調(diào)節(jié)Ca2+，不與Gαi/o/s作用[48]；WIN-55212-2（化合物 12）對(duì) Gαi和 Gαs作用強(qiáng)度相當(dāng)，均優(yōu)先于Gαo。因此，目前絕大部分研究集中于G蛋白與β-arrestin之間的偏向性，而針對(duì)G蛋白不同亞組之間的偏向性研究較少，化合物結(jié)構(gòu)特征與G蛋白亞組偏向性之間無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。

4.2 CB2配體偏向性

CB2的配體偏向性是由Shoemaker等[61]首次發(fā)現(xiàn)。CB2主要與Gα蛋白偶聯(lián)，CB2是否可以與其他G蛋白結(jié)合尚不清楚[52,62]。所以，對(duì)于CB2受體的研究主要是G蛋白和β-arrestin通路之間的偏向性。CP55940（化合物5）在兩者間不存在明顯的偏向性，以它作為對(duì)照化合物，AEA（化合物3）沒有顯示出偏向性；而HU910（化合物13）、HU308（化合物14）在人和小鼠的CB2呈現(xiàn)出不同的信號(hào)傳導(dǎo)偏向性，它們?cè)谌薈B2（hCB2）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表現(xiàn)為無偏向的平衡的激動(dòng)劑，但在小鼠CB2（mCB2）上相對(duì)于β-arrestin通路，明顯偏向于G蛋白信號(hào)通路[63]。因此，在測(cè)試配體時(shí)，需要考慮到種屬間差異。2-AG（化合物2）、THC（化合物4）、WIN-55212-2（化合物 12）、JWH-133（化合物 15）和JWH015（化合物16）表現(xiàn)為G蛋白偏向性，而MH（化合物17）、AM1710（化合物18）、AM1248（化合物19）、STS-135（化合物20）和AM1241（化合物21）顯示出β-arrestin偏向性質(zhì)。LY2828360（化合物22）是G蛋白偏向性CB2激動(dòng)劑，可減輕化療藥物誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛，而不會(huì)產(chǎn)生耐受性，并可以延長阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用時(shí)間，同時(shí)降低阿片類藥物的依賴性[64]。因此，對(duì)于每個(gè)結(jié)構(gòu)類型，如植源性大麻素和大麻類似物或氨基吲哚類，它們結(jié)構(gòu)差異不大，但有時(shí)偏向性質(zhì)卻相反[65-66]；或者結(jié)構(gòu)發(fā)生微小的變化，其偏向性往往就會(huì)發(fā)生較大變化，這也使得對(duì)于偏向性配體的構(gòu)效關(guān)系的研究變得困難（見表2）。此外，CB2配體有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，相關(guān)研究也比較多，但有關(guān)偏向性配體對(duì)其功能的影響研究極少。

表 2 代表性CB2偏向性配體Table 2 Representative CB2 biased ligands

5 結(jié)語

綜上所述，大麻素受體是疼痛、肥胖、炎癥以及精神疾病的靶標(biāo)，是一個(gè)非常有吸引力的研究領(lǐng)域?！捌蛐耘潴w”概念的提出為GPCR信號(hào)傳導(dǎo)研究以及靶向性藥物研發(fā)帶來了更多方向。目前，已有證據(jù)表明配體偏向性與不良反應(yīng)密切相關(guān)，例如對(duì)血管緊張素Ⅰ型受體、阿片受體等具有偏向性的配體明顯降低了藥物不良反應(yīng)，偏向性CB2受體配體LY2828360發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)可減少藥物依賴性等，因此偏向性配體值得進(jìn)一步研究。大麻素受體CB1和CB2作為GPCR家族的一員，其偏向性作用的研究尚處于初期階段，但由于其是多效應(yīng)偶聯(lián)的GPCR，可介導(dǎo)多種生理反應(yīng)，所以被廣泛認(rèn)為是研究偏向性信號(hào)傳導(dǎo)的理想模型。因此，鑒定和表征具有偏向性的配體對(duì)進(jìn)一步闡明大麻素受體偏向性激動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制具有重要價(jià)值。由于CB1和CB2氨基酸整體序列的同源性為44%，跨膜區(qū)序列同源性高達(dá)68%，同時(shí)，兩者結(jié)合口袋關(guān)鍵殘基高度一致，使得發(fā)展偏向性大麻素受體配體具有較高挑戰(zhàn)性，而發(fā)展專一信號(hào)通路大麻素受體配體有利于研究信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，也有利于研究不良反應(yīng)與具體信號(hào)通路的相關(guān)性，從而研發(fā)出低不良反應(yīng)的大麻素配體。