焦 云， 鄔玉芬， 舒巧云

(1.寧波市農業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所， 浙江 寧波 315040； 2.寧波市寧?？h林特技術推廣中心， 浙江 寧波 315600)

榧樹(Torreyagrandis)為紅豆杉科植物，雌雄異株，是我國特有珍稀樹種，以浙江省紹興市的會稽山區(qū)為主要栽培中心。浙江省香榧栽培面積逐年擴大，寧波、嵊州等地已形成規(guī)?；B片種植區(qū)。目前，研究主要集中于榧樹雌株種質資源收集、遺傳多樣性分析和果實品質分析等方面[1-4]，對榧樹雄株種質資源的綜合評價等方面研究報道較少，多數(shù)農戶缺乏香榧授粉樹配置及授粉相關技術指導，對雄榧樹保護不力，毀壞嚴重，因此，開展榧樹雄株種質資源的收集和評價工作已迫在眉睫。SSR分子標記技術已經廣泛應用于杏[5]、柚[6]、桃[7]、荔枝[8]和榧樹[9]等遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等方面，在榧樹上的應用主要針對其栽培品種及各種野生資源的遺傳多樣性進行分析，而對榧樹雄株種質的遺傳來源及多樣性研究涉及甚少。鑒于此，研究利用SSR分子標記綜合分析榧樹雄株的遺傳多樣性，為進一步挖掘優(yōu)良榧樹雄株種質資源和雜交育種中親本的選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為50份榧樹資源，包括2株雌雄同株、6株雌株及42株雄株。榧樹資源原始來源均為紹興嵊州，2011—2013年期間相繼移栽至寧波寧海和余姚等地。至2020年榧樹樹齡均為11年。50份榧樹資源信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、SSR引物合成與PCR擴增 2020年4月分別采集50份榧樹無病蟲害的嫩葉，使用Ezup 柱式植物基因組 DNA 抽提試劑盒(上海，生工生物工程股份有限公司)提取其基因組DNA。委托上海生工生物工程股份有限公司合成榧樹相關SSR引物(課題組前期研究已開發(fā))；PCR擴增反應體系及具體方法參照JIAO等[10]的方法進行。

1.2.2 基因型分型檢測與數(shù)據(jù)分析 取上述擴增產物等比例混合后，委托上海生工生物工程股份有限公司在ABI3730遺傳分析儀進行檢測。擴增產物片段大小用GeneMapper Software version 3.7(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行讀數(shù)，只統(tǒng)計長度為100～500 bp的擴增產物片段，使用Excel 2007構建數(shù)據(jù)矩陣表，使用POPGENE 1.32計算所有引物組合的Shannon信息指數(shù)和有效等位基因數(shù)?；贒ice系數(shù)[11]遺傳距離，使用非加權組平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means, UPGMA)及Free Tree 0.9.1.50進行聚類分析，其中bootstrap值設置為1 000，聚類圖使用Tree view 1.6.6修改。

表1 50份榧樹資源的采集信息

2 結果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性

使用50份榧樹資源對SSR引物進行多態(tài)性評價，共擴增出48個條帶，平均每個引物可擴增8個條帶(表2)。此外，平均有效等位基因位點數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為3.383 4和 1.442 5。期望雜合度為0.531 5(XF111910)～0.818 4(XF2096)；每個引物組合擴增條帶數(shù)量為5～11條，其中，XF2096擴增條帶數(shù)量最多(11條)，多態(tài)性指數(shù)最高(1.946 7)。

表2 SSR引物多態(tài)性信息

2.2 榧樹雄株資源的遺傳多樣性

基于6對SSR分子標記分型產生的48個片段矩陣及遺傳距離，采用UPGMA法構建50份榧樹資源的遺傳親緣關系聚類樹(圖1)。不同榧樹資源間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.98，表明50份榧樹資源之間存在一定的遺傳多樣性。當遺傳相似系數(shù)約為0.68時，可將所有榧樹資源分為4個組。A組包含A-1和A-2亞組，A-1亞組包括10份榧樹資源，其中包括珍珠榧資源；A-2亞組包括6份榧樹資源，均為來自寧波的榧樹雄株。B組包含B-1和B-2亞組，B-1亞組包括7份榧樹資源；B-2亞組包括4份榧樹資源，分別為2020CX-2、2020CX-4雌雄同株和來自嵊州的雄株2020X-5和2020X-6。C組僅包含2份榧樹資源，均為來自寧海的榧樹雄株。D組包含D-1和D-2亞組，盡管茄榧和細榧等雌株同劃分于D-1和D-2亞組，但其均劃分于相對獨立的分支。由此可見，上述雌株與雄株遺傳來源具有一定差異。此外，值得注意的是，50份榧樹資源的遺傳親緣聚類與其來源地區(qū)存在一定聯(lián)系，但與其盛花期關系不明顯。

3 結論與討論

榧樹為雌雄異株植物，為提升其產量獲得更高的經濟價值，部分生產單位多采用人工輔助授粉技術措施。然而，由于部分農戶貪圖采集雄株花粉便利和缺乏可持續(xù)經營理念，大肆砍伐雄株，使雄株資源受到極大破壞，部分產區(qū)雌雄株比例嚴重失調，因此，收集和保護雄株種質資源，并開展相關遺傳多樣性分析與授粉技術研究是當務之急。為挖掘優(yōu)良榧樹雄株種質資源和雜交育種親本選擇奠定基礎，運用SSR分子標記技術對50份不同區(qū)域來源的榧樹資源進行研究，分析榧樹雄株的遺傳多樣性。結果表明，每對SSR引物平均可擴增獲得8個條帶，高于前期研究結果[12]。由此可見，榧樹雄株具有較為豐富的遺傳多樣性。此外，通過對50份榧樹資源進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，聚類結果與地域來源存在一定的關系，與雄花盛花期沒有較為明顯的關聯(lián)性，意味著榧樹雄株盛花期具有更為復雜的遺傳決定機制。

榧樹雄株的性狀如花粉量、始花期及花期長短等是香榧生產中雌雄配置的核心理論依據(jù)。因此，建立榧樹雄株種質資源圃，開展榧樹雄株花期、花粉出粉量、生活力等綜合評價及授粉優(yōu)株篩選，探索雄株早期快速鑒定的實驗方法，建立和完善榧樹人工輔助授粉技術，對于全面提高香榧產量和質量及促進香榧產業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。研究采用SSR分子標記對榧樹雄株的遺傳多樣性進行綜合評價，對后續(xù)榧樹授粉樹配置和合理選配親本以及開展品種選育研究工作具有一定指導意義。