劉彥廷 鄧遠(yuǎn)國 羅 然 孫 拯 張學(xué)軍 田春雷

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 神經(jīng)外科， 湖北 宜昌 443003； 2. 當(dāng)陽市人民醫(yī)院 神經(jīng)外科， 湖北 宜昌 444100)

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)較為常見的慢性疾病，其本質(zhì)是腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的功能障礙。目前臨床以口服藥物、癲癇病灶手術(shù)切除或神經(jīng)電刺激為主要治療方法，但均有不容忽視的副作用[1]。因此，深入探索癲癇發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)抑制癲癇的發(fā)生及發(fā)展有重要意義。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs可通過與癲癇相關(guān)mRNAs形成復(fù)合物，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNAs翻譯，對(duì)腦神經(jīng)元細(xì)胞增殖、神經(jīng)突觸形成、神經(jīng)損傷修復(fù)等發(fā)揮作用，從而影響癲癇發(fā)生[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在癲癇動(dòng)物模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在差異性表達(dá)，其表達(dá)量與癲癇嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3]。在海馬硬化(hippocampal sclerosis，HS)和局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)患者中，F(xiàn)CD患者miR-195的含量低于HS患者，伴隨上游趨化因子的表達(dá)變化[4]。此外，miR-195還可調(diào)控細(xì)胞周期，降低補(bǔ)體因子H，可能對(duì)腦神經(jīng)元細(xì)胞的功能發(fā)揮影響，改變癲癇發(fā)生的易感性，但其具體機(jī)制尚不明確[5]。因此，本研究擬通過構(gòu)建癲癇小鼠模型，觀察miR-195在癲癇小鼠皮質(zhì)中的表達(dá)含量是否存在差異，并觀察miR-195能否通過調(diào)控下游靶蛋白而影響小鼠的癲癇發(fā)作，以期在分子層面為癲癇診治提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 匹羅卡品癲癇小鼠模型及Racine評(píng)分系統(tǒng)

40只雄性C57BL/6小鼠購自華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫條件下飼養(yǎng)。硫酸阿托品(0.2 mL/100 g)腹腔注射30 min后，按腹腔注射藥物不同分為匹羅卡品(300 mg/kg)組與等量生理鹽水組，每組20只[6]。按照經(jīng)典的Racine評(píng)分[7]系統(tǒng)對(duì)小鼠行為進(jìn)行觀察。藥物注射30 min后，對(duì)未出現(xiàn)3級(jí)以上癲癇發(fā)作的小鼠追加匹羅卡品(100 mg/kg)腹腔注射1～2次，仍未出現(xiàn)3級(jí)以上者剔除實(shí)驗(yàn)。采用地西泮(0.2 mL/100 g)終止持續(xù)性的癇性發(fā)作。最后將miR-195 mimics或miR-mimics-NC立體定向下注射入生理鹽水組小鼠側(cè)腦室；將miR-195 inhibitor或miR-inhibitor-NC注射入匹羅卡品組小鼠側(cè)腦室，每組10只，持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察1周，記錄1周內(nèi)小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)。3.5%水合氯醛(10 mg/kg)麻醉小鼠后分離腦皮質(zhì)用于后續(xù)研究。Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：無任何陣攣樣發(fā)作；1級(jí)：靜止不動(dòng)，嘴及面部陣攣及咀嚼運(yùn)動(dòng)；2級(jí)：在1級(jí)表現(xiàn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭，頭面部陣攣；3級(jí)：在2級(jí)表現(xiàn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)單側(cè)前肢抽搐；4級(jí)：在3級(jí)表現(xiàn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)雙側(cè)前肢的抽搐，伴有軀干直立；5級(jí)：在上述所有癥狀的基礎(chǔ)上出現(xiàn)四肢節(jié)律性抽搐，伴有跌倒及翻滾。

1.2 試劑與藥品

兔抗Clusterin抗體購自美國SantaCruz公司；過氧化物辣根Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TAKARA公司；Markers、RNA 酶抑制劑、HindⅢ酶、Xba I 酶購自Invitrogen生物技術(shù)有限公司。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)液購自武漢博士德生物公司。

1.3 RT-PCR

從小鼠皮層組織提取總RNA，用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miR-195-5p特異性反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。按照說明書流程，采用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR。miR-195-5p mimics、Negative control、β-actin引物序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成，序列如下：miR-195-5p mimics序列引物：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3；設(shè)U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT值表示miR-195相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 免疫熒光雙染法鑒定皮層神經(jīng)元

將制備成功的癲癇腦皮層組織采用4%多聚甲醛固定，處理15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2～3次后封閉液作用30 min，Triotn X-100破膜后依次滴加Clusterin(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗2～3次后滴加相應(yīng)二抗(工作濃度為1∶100)，避光、室溫條件下作用30 min，沖洗數(shù)次后采用DAPI染胞核，PBS沖洗后滴加甘油封片。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡(Nikon，日本)采集圖像。圖像采用Image Pro軟件，計(jì)算Clusterin陽性指數(shù)(positive index，PI)=陽性平均光密度值×陽性面積百分率。

1.5 Western Blot

取小鼠腦皮層組織，提取總蛋白后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白。將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜后脫脂乳封閉2 h，4℃下加入Clusterin(1∶1 000)抗體搖床孵育， PBS沖洗3次后，滴加二抗(1∶2 000)，室溫下溫育2 h。滴加化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)2 min，使用ChemiDocMP顯像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建匹羅卡品癲癇小鼠發(fā)作模型

將C57BL/6小鼠按注射藥物分為匹羅卡品組(300 mg/kg，n=20)和等量生理鹽水組(n=20)。按Racine評(píng)分記錄1周內(nèi)小鼠3級(jí)及以上行為次數(shù)。結(jié)果顯示：匹羅卡品組小鼠3級(jí)及以上行為次數(shù)為(84.6±11.5)，高于生理鹽水組小鼠(16.7±3.2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-195 在匹羅卡品癲癇小鼠模型腦皮層組織中的表達(dá)情況

取匹羅卡品組和生理鹽水組小鼠腦皮層組織，行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：匹羅卡品組小鼠的miR-195相對(duì)表達(dá)量高于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。

2.3 miR-195靶基因預(yù)測及驗(yàn)證

通過Target Scan(http://www.targetscan.org/)與miR Base(http://www.mirbase.org/)網(wǎng)站，對(duì)miR-195靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選出癲癇發(fā)作相關(guān)蛋白Clusterin的3′UTR區(qū)核酸序列與miR-195核心區(qū)域存在堿基互補(bǔ)(圖1B)。Western blot結(jié)果顯示：匹羅卡品組小鼠腦皮層組織中Clusterin含量低于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1C和1D。

2.4 miR-195對(duì)小鼠Clusterin蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示：生理鹽水組小鼠皮層組織中，miR-195 mimics的Clusterin陽性細(xì)胞PI值為(18.36±4.17)，低于miR-mimics-NC的(35.24±5.08)(P<0.05)。匹羅卡品組小鼠皮層組織中，miR-195 inhibitor的Clusterin陽性細(xì)胞PI值為(52.72±7.53)，高于miR-inhibitor-NC的(29.06±4.25)(P<0.05)，見圖2。

2.5 miR-195對(duì)大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)的影響

按Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記錄注射后1周內(nèi)小鼠3級(jí)及以上行為次數(shù)。結(jié)果顯示：生理鹽水組中，miR-195 mimics小鼠發(fā)作次數(shù)為(42.7±5.5)，高于miR-mimics-NC小鼠的(11.6±3.2)(P<0.05)。匹羅卡品組中，注射miR-inhibitor的小鼠發(fā)作次數(shù)為(30.1±5.6)，低于與miR-inhibitor-NC組的(73.4±8.2)(P<0.05)。

3 討論

miRNAs在神經(jīng)元細(xì)胞能量代謝、神經(jīng)突觸形成及神經(jīng)干細(xì)胞特性維持等方面發(fā)揮重要作用。它可通過影響細(xì)胞炎性因子趨化，細(xì)胞周期及增殖等調(diào)控癲癇發(fā)作。如miR-134通過干擾神經(jīng)細(xì)胞興奮性閾值或神經(jīng)元微結(jié)構(gòu)，增加低濃度Mg2+誘導(dǎo)小鼠癲癇模型的異常腦電活動(dòng)[8]。miR-146a可通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，降低補(bǔ)體因子H，緩解癲癇癥狀[9]。miR-324主要參與細(xì)胞增殖和干細(xì)胞分化，影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性而發(fā)揮重要作用[10]。與之類似的miRNAs還包括miR-155和miR-124等[11]。因此，miRNA可能參與癲癇的發(fā)生機(jī)制。

本研究中，匹羅卡品刺激小鼠后，其腦皮層組織miR-195含量明顯增加，提示miR-195與癲癇發(fā)作存在正相關(guān)。miR-195可明顯增加小鼠癲癇發(fā)作頻率，出現(xiàn)Racine評(píng)分3級(jí)以上行為，且部分小鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，提示miR-195對(duì)腦皮層細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性破壞。既往研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中，miR-195可引起心臟病理性生長和心功能障礙，同樣提示miR-195對(duì)心肌細(xì)胞存在結(jié)構(gòu)性破壞[12]。通過miR Base信息分析，對(duì)miR-195下游靶基因進(jìn)行篩選分類后發(fā)現(xiàn)，其靶點(diǎn)范圍涉及細(xì)胞微結(jié)構(gòu)跨膜蛋白，細(xì)胞周期及炎性趨化因子等[13]。miR-195增加癲癇發(fā)作，可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子活性，抑制下游基因；或通過炎癥誘導(dǎo)等途徑，干擾巨噬細(xì)胞M1/M2型轉(zhuǎn)化；或通過調(diào)控細(xì)胞周期，共同參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。

癲癇發(fā)作與神經(jīng)細(xì)胞電生理學(xué)變化密切相關(guān)，涉及多個(gè)離子通道的活性變化。如miR-132、miR-134 等可通過改變樹突棘形態(tài)影響神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，或者靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮性突觸受體的GluA2亞基，減少樹突棘的形成，降低興奮性突觸后電流[14]。在局灶性發(fā)育不良所導(dǎo)致的癲癇模型中發(fā)現(xiàn)，miR-199a通過靶向抑制雷帕霉素靶蛋白通路，提高癲癇持續(xù)狀態(tài)后甘氨酸受體水平，降低小鼠自發(fā)性癲癇頻率[15]。既往研究顯示，miR-195不僅可影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，改變細(xì)胞侵襲能力，還可以降低細(xì)胞Ca2+離子通道活性，減少多烯紫杉醇跨膜泵出[16]。本研究中，miR-195含量增加后可加重癲癇發(fā)作，但是否削弱突觸可塑性，干擾樹突棘形成及電流，有待進(jìn)一步研究。

叢生蛋白(Clusterin)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，是miR-195的靶基因之一。Clusterin是高度保守的異二聚體分泌的糖蛋白，參與細(xì)胞膜重構(gòu)、神經(jīng)元突觸形成和細(xì)胞基質(zhì)形成[17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Clusterin蛋白在癲癇患者腦脊液及血液中含量低于正常人群，尤其在藥物治療效果不佳的患者中，表達(dá)量明顯降低，提示Clusterin與癲癇存在關(guān)聯(lián)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Clusterin主要分布于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)miR-195含量增高后，小鼠癲癇發(fā)作頻率明顯增加，同時(shí)伴隨腦皮質(zhì)中Clusterin表達(dá)降低，證明Clusterin含量隨癲癇發(fā)作的改變出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。既往研究通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Clusterin可與微管解聚蛋白結(jié)合，抑制微管解聚蛋白對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的破壞，對(duì)神經(jīng)性損傷及突觸發(fā)揮保護(hù)作用，抑制癲癇的發(fā)生[19]。因此推測miR-195加重癲癇發(fā)作，可能與抑制Clusterin活性、降低Clusterin神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

目前miRNA 還可以作為癲癇的生物標(biāo)記物，用于癲癇發(fā)作的預(yù)測和藥物敏感性判斷。除癲癇患者腦皮質(zhì)和海馬組織，miRNAs在癲癇患者血液、腦脊液中也存在著差異性表達(dá)。隨著對(duì)其研究的不斷深入，miRNA有望成為癲癇相關(guān)病理過程中的重要靶點(diǎn)，為臨床上癲癇的治療提供新思路。